肝细胞癌患者循环肿瘤细胞检测阳性率与射频消融治疗后短期疗效的相关性

马 超 何 华 董亚冰 赵玲玲 赵恒军 王楠娅

(吉林大学第一医院肿瘤中心，吉林 长春 130021)



肝细胞癌患者循环肿瘤细胞检测阳性率与射频消融治疗后短期疗效的相关性

马 超 何 华 董亚冰 赵玲玲 赵恒军 王楠娅

(吉林大学第一医院肿瘤中心，吉林 长春 130021)

目的 探讨肝细胞癌(HCC)患者循环肿瘤细胞(CTC)的检出率与其他血清肿瘤标志物及射频消融治疗后短期疗效的相关性。方法 选择37例HCC并进行射频消融治疗的患者，术前均进行CTC检测，并搜集患者临床特征、血清甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)的水平。术后1、3个月分别进行肝脏增强CT/MRI的检查，依据mRECIST标准评价患者的短期疗效，并应用Fisher精确检验法统计术前外周血CTC的检出率及其与AFP、AFP-L3肿瘤标志物水平、射频消融治疗后短期疗效的关系。结果 术前CTC阳性患者为8例(21.6%)。其中巴塞罗那(BCLC)分期为0～A期20例，CTC检测阳性者7例(35%)，BCLC分期为B～C期17例，CTC检测阳性者1例(5.9%)，不同BCLC分期患者CTC阳性率有统计学差异(P=0.048)。经过射频消融治疗后，21例在1个月和3个月时进行疗效评价达完全缓解(CR)，16例为部分缓解(PR)或在3个月内疾病进展。3个月内复查达到CR的21例有3例(14.3%)CTC检测阳性。疗后达PR或3个月内进展的16例中5例(31.3%)CTC阳性。两组无统计学差异(P=0.254)。8例CTC阳性的患者中有1例AFP>400 ng/ml、5例AFP-L3>1；CTC阴性的29例患者中有8例表现为AFP>400 ng/ml、4例表现为AFP-L3>1，两组AFP水平无统计学差异(P=0.649)、AFP-L3水平有明显差异(P=0.012)。结论 初诊为中晚期HCC患者的CTC检测阳性率无显著提高，随AFP-L3水平升高CTC阳性率增高，但对于AFP而言该趋势不明显。

肝细胞癌；循环肿瘤细胞；射频消融

循环肿瘤细胞(CTC)是指存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶脱落而进入外周血液中，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着于相应的器官最终发展成为转移灶，从而增加恶性肿瘤患者的死亡风险〔1〕。CTC的检测可以用于预测某些实体肿瘤的预后及指导治疗。但是，肝细胞癌(HCC)患者血清CTC的检出率、CTC的水平与治疗或预后的关系仍不明确。本研究将以此为研究重点，为寻找对HCC有预测、预后价值的生物标志物提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2012年9月至2013年3月期间在我院肿瘤内科经影像学及病理活检确诊为HCC患者37例，男31例，女6例。年龄36～77(中位53)岁。HCC病理学诊断依照 WHO 肿瘤分类及诊断标准，分期根据巴塞罗那(BCLC)分期标准进行0期2例，A期18例，B期10例，C期7例。甲胎蛋白(AFP)≥400 ng/ml 9例；甲胎蛋白异质体(AFP-L3)>1 28例；伴发病毒性乙型肝炎者31例；伴发病毒性丙型肝炎者6例。

1.2 外周血标本的预处理 CellSearch系统由CellTracks AutoPrep、CellTracks AnalyzerⅡ分析仪以及CellSave储存管、试剂盒组成。CellSave专用收集管采集患者外周血液，标记批量处理中每个患者样本的15 ml锥形管，倒置5次，混合批次中所有CellSave储存管，从每个CellSave储存管向相应标记的锥形管中倒入7.5 ml血液，向每个锥形管中加入6.5 ml稀释缓冲液，盖紧含有血液和稀释液的锥形管，并倒置5次进行混匀，离心10 min，样本制备好后1 h内在CellTracks AutoPrep系统上处理。采血后于室温储存并于96 h内进行检测。

1.3 CTC检测操作步骤 CellSearch试剂盒包括上皮细胞黏附分子抗体(EpCAM)包被的免疫磁珠、细胞角蛋白(CK)及白细胞分化抗原45(CD45)的荧光抗体、细胞固定剂和缓冲液。标本经预处理后在CellTracks AutoPrep系统上进一步采用含有免疫磁珠的试剂进行孵育，通过纳米磁珠捕获靶细胞(即EpCAM阳性细胞)，细胞固定后分别加入藻红蛋白标记的CK8/18/19抗体，藻蓝蛋白标记的CD45抗体，而后应用荧光染料标记结合的靶细胞。此后，经上述处理的样本注入样本盒中，在MagNest装置中，捕获的细胞迁移至分析表面，在此由CellTracks AnalyzerⅡ分析仪的成像软件进行计算分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1 治疗前CTC检测结果 8例(21.6%)治疗前CTC检测结果为阳性，其中，BCLC分期为0～A期20例中CTC检测阳性者7例(35%)；B～C期17例中CTC检测阳性者1例(5.9%)，不同BCLC分期的HCC患者CTC阳性率差异显著(P=0.048)。

2.2 治疗后短期内疗效与治疗前CTC检测结果分析 经射频消融治疗后依据mRECIST标准对患者的病情进行评估，有21例病情达到完全缓解(CR)，其中3例(14.3%)表现为治疗CTC阳性。16例治疗后病情表现为部分缓解(PR)或3个月内进展，其中5例(31.3%)为治疗前CTC检测阳性。两组阳性率差异无统计学意义(P=0.254)。

2.3 CTC检测结果与AFP、AFP-L3的相关性 在CTC阳性的8例患者中，有1例(12.5%)AFP>400 ng/ml、5例(62.5%)AFP-L3>1，CTC阴性的29例中8例(27.6%)的AFP>400 ng/ml、4例(13.8%)AFP-L3>1，两组AFP水平差异无统计学意义(P=0.649)、AFP-L3水平有明显差异(P=0.012)。

3 讨 论

对于肿瘤，早期诊断和治疗是提高生存率的关键〔2，3〕。就HCC而言，常规的影像学检查并不能发现微小浸润性病变，亦不能对疾病做出准确评判〔4〕。

郭柏棠〔5〕应用CanPatrolTMCTCs技术对296例HCC患者进行CTC检测，结果显示阳性率达71.43%，而且治疗前CTC阳性患者无瘤生存期较CTC阴性患者明显缩短，患者CTC水平与BCLC分期呈正相关。Kornelius等〔6〕应用CellSearch系统检测了59例HCC患者CTC水平，30.5%的患者检测到了CTC的存在，进一步分析提示CTC阳性率与BCLC分期相关，即分期越晚阳性率越高，而且CTC阳性患者往往伴随AFP水平的升高。Sun等〔7〕在一项研究中纳入123例HCC患者，治疗前CTC检测阳性率为66.67%，研究以每7.5 ml血液中2个CTC为临界值，结果显示手术前CTC≥2个/7.5 ml血样可作为疾病复发的预后指标。

本研究部分结果与上述结果有偏差，如BCLC分期为0～A期的患者CTC检测阳性率较B～C期患者高，且CTC 阳性与AFP水平无明显相关性，可能系样本量过少产生偏倚所致，但是综合分析上述几组研究结果可以看出CTC检测对于HCC有一定预后意义，高的CTC检出率与高的CTC水平往往伴随不良的生存结局。CTC作为新的生物学标志物值得进一步深入研究，但当今关于HCC患者CTC的相关研究以单中心、小样本居多，应当积极进行多中心、大样本、前瞻性分析尽力探索CTC在HCC中的应用价值〔8〕。AFP是目前HCC诊断及监测复发最常用的指标，但对于那些低AFP水平甚至AFP阴性的患者，CTC对于疾病复发的预测则更具优势〔9〕，而且AFP也并非预测HCC细胞播散的敏感指标，例如在本研究中，部分患者CTC呈阳性，但是AFP却处于正常水平；应加快研究CTC在HCC疗效评价中的作用，通过在临床治疗前进行CTC检测建立基数水平，在治疗过程中监测 CTC数目的变化从而明确治疗效果及疾病进展情况，从而使临床医生能更好地为患者制订个性化治疗方案，尽量避免医疗资源的浪费〔10〕；另外，在精准医疗逐渐到来的时代，可以通过CTC从分子生物学角度更好地反映疾病特征，或许在此过程中可以找寻到新的治疗靶点，最终应用于临床造福患者〔11〕。

1 滕 飞，傅志仁.肝细胞肝癌循环肿瘤细胞研究进展及其在肝移植中的应用前景〔J〕.中华移植杂志，2013；7(3)：29-33.

2 Forner A，Llovet IM，Bruix J.Hepatocellular carcinoma〔J〕.Lancet，2012；379：1245-55.

3 Sherman M.Hepatocellular carcinoma：epidemiology，risk factors，and screening〔J〕.Semin Liver Dis，2005；25(2)：143-54.

4 Rodriguez-Peralvarez M，Luong TV，Andreana L，etal.A systematic review of microvascular invasion in hepatocellular carcinoma：diagnostic and prognostic variability〔J〕.Ann Surg Oncol，2013;20(1)：325-39.

5 郭柏棠.肝细胞癌患者循环肿瘤细胞检测与预后关系的初步研究〔D〕.广州：南方医科大学，2015：1-60.

6 Kornelius Schulze，Christin Gasch，Katharina Staufer，etal.Presence of EpCAM-positive circulating tumor cells as biomarker for systemic disease strongly correlates to survival in patients with hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Cancer，2013；133(9)：2165-71.

7 Sun YF，Xu Y，Yang XR，etal.Circulating stem cell-like epithelial cell adhesion molecule-positive tumor cells indicate poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative resection〔J〕.Hepatology，2013；57(4)：1458-68.

8 龙建云，李 静，黄 亮，等.肝癌循环肿瘤细胞临床应用研究进展〔J〕.肝胆胰外科杂志，2016；28(1)：79-83.

9 Wong KF，Xu Z，Chen J，etal.Circulating markers for prognosis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Exp Opin Med Diagn，2013；7(4)：319-29.

10 Liu MC，Shields PG，Warren RD，etal.Circulating tumor cells：a useful predictor of treatment efficacy in metastatic breast cancer〔J〕.J Clin Oncol，2009;27：5153-9.

11 Kelley RK，Magbanua MJM，Butler TM，etal.Circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma：a pilot study of detection，enumeration，and next-generation sequencing in cases and controls〔J〕.BMC Cancer,2015;15：206.

〔2015-12-31修回〕

(编辑 曹梦园)

国家自然科学基金青年基金资助项目(81201673)；吉林省教育厅课题资助(440030031191)；吉林大学优秀青年教师培育计划(419080500365)；吉林大学白求恩培育计划(470110000488)

王楠娅(1980-)，女，副教授，主要从事肝癌研究。

马 超(1989-)，男，硕士，主要从事恶性肿瘤研究。

R73

A

1005-9202(2016)20-5047-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.050