检测方法　猪伪狂犬病毒分子生物学检测方法研究进展

2016-01-31于新友李天芝王金良山东绿都生物科技有限公司山东滨州56600滨州市科学技术局山东滨州56600山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州56600

猪业科学 2016年1期

关键词：分子生物学检测方法

于新友，李天芝，高鹏，王金良(.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 56600；.滨州市科学技术局，山东滨州 56600；.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 56600)

检测方法猪伪狂犬病毒分子生物学检测方法研究进展

于新友1，李天芝1，高鹏2，王金良3
(1.山东绿都生物科技有限公司，山东滨州 256600；2.滨州市科学技术局，山东滨州 256600；3.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600)

摘要：通过综述猪伪狂犬病病毒分子生物学检测方法，主要包括核酸探针、常规PCR方法、套式PCR方法、多重PCR方法、荧光定量PCR方法、环介导等温扩增等6种方法，希望对猪狂犬病病毒病防控有一定的参考价值。

关键词：猪狂犬病病毒；分子生物学；检测方法

伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(除猪外)和急性脑脊髓炎等为主要症状的疱疹病毒，由该病毒引起的疾病症状似狂犬病，故称为伪狂犬病。1702年由匈牙利学者Aladar Aujeszky首次报道本病，目前该病在世界上50多个国家和地区范围广泛分布。猪是PRV的贮存宿主和传染源，健康猪与患猪、带毒猪直接接触可感染该病。主要引起母猪繁殖障碍、流产、产木乃伊胎、死胎和产弱仔，初生仔猪表现为腹泻及神经症状，感染率和死亡率可达100%，给养猪业造成了严重的经济损失。分子生物学检测方法以检测快度、灵敏度高、特异性好等特点已经广泛应用于细菌和病毒病的检测，并展示良好的应用前景。笔者就目前国内外PRV检测的分子生物学方法的最新研究进展进行综述，为猪伪狂犬病的防控提供参考。

1 核酸探针

核酸探针又称核酸杂交，利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列（靶序列）的有标记的一段单链DNA(或RNA)分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术。魏伟等[1]用光敏生物素标记PRV特异性糖蛋白gP50基因中的222 bp片段和重组子pup制备的探针，分别检出了46.8 pg和93.6 pg的PRV DNA，且pup探针只与PRV呈杂交阳性，建立了PRV核酸探针检测技术。郭万柱等[2]用P32标记的PRV基因组DNA或克隆片段对病毒DNA和感染猪组织DNA进行斑点杂交，结果检出了10 pg的病毒DNA。刘志杰等[3]通过PCR扩增了一段304 bp的猪伪狂犬病毒gE基因片段，将其作为核酸探针来对PRV野毒株进行检测。经试验证明该探针只与同源DNA出现阳性杂交信号，而与PRV Bartha-k61株疫苗毒DNA、PPV DNA、PCV DNA、PRRSV cDNA、CSFV cDNA的杂交结果均为阴性，具有良好的特异性，敏感性检测结果表明，该探针最低可检出4 pg的同源DNA，具有很高的灵敏度。

2 常规PCR 方法

PCR方法是根据目的片段设计引物，借助仪器和DNA聚合酶体外大量扩增部分或全部目的片段，是一种快速、简便、特异的诊断方法。董浩等[4]建立了猪伪狂犬病毒疫苗株与野毒株鉴别PCR检测方法，结果显示，该法可对PRV Fa野毒株扩增出354 bp、237 bp的2条核酸酸片段，从PRV Bartha-K61疫苗株仅扩增出1条237 bp的片段，对PCV2、PPV、CSFV、PRRSV的扩增结果均为阴性。张婕等[5]根据已发表的猪伪狂犬病病毒gE基因核酸序列，设计合成1对引物，扩增片段长度为276 bp，优化PCR反应条件，建立检测PRV野毒的PCR方法，利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份，阳性样品18份，阳性率达52.94% (18/34)。王香玲等[6]根据猪伪狂犬病毒(PRV) gE基因序列保守区段，设计一对特异性引物，通过优化反应条件，建立了可区分猪伪狂犬病毒野毒株与基因缺失疫苗株的PCR检测方法，并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了验证。结果显示，该PCR方法可扩增出388 bp的目的片段，对模板的最低检测量为1.1 pg，与猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪支原体、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应，具有高特异性。

3 套式PCR方法

套式PCR方法是设计内外2种引物，同时扩增2次，该法能节省模板，且敏感性较高。张志等[7]建立了能够特异性检测PRV野毒株的套式PCR方法。与常规PCR相比，该方法检测极限可达10个病毒拷贝/μL，是常规PCR的1 000倍，并与猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒等不存在交叉反应现象。在对临床150份样品检测时，套式PCR的阳性率为21.33%，常规PCR的阳性率为10%。

4 多重PCR方法

多重PCR是在常规PCR基础上发展起来的，在同一PCR体系中，加入多对引物，同时检测2种或多种病原核酸，它具有快速、灵敏度高、特异性强等优点广泛用于各种临床疾病的快速诊断。赵绪永等[8]建立检测PRV，PPV和PCV2的多重Real-time PCR方法，并对其敏感性、重复性和特异性进行检验，结果显示，该法具有高度特异性，与其他病原无明交叉反应，检测灵敏度高，可检出1.0×101拷贝/μL的阳性质粒或1TCID50/mL的病毒样品。韩勇[9]建立了一种同时检测PPV 和PRV的二重PCR方法，对PPV和PRV扩增片段大小分别为942bp和485 bp的片段，特异性试验表明，对其他几种病原的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明，该二重PCR能检出 PPV和PRV最低浓度分别为22、11.7 pg/L。程亮亮等[10]根据GenBank中登录的HP-PRRSV Nsp2基因缺失区和PRV gB基因保守区序列，分别设计并合成两对特异性扩增引物，通过对反应条件优化，建立了能够同时检测HP-PRRSV和PRV的双重PCR诊断方法。利用建立的双重PCR方法对30份临床可疑样品进行检测，并与商品化单项PCR试剂盒进行对比验证。结果表明，本试验建立的双重PCR方法具有较高的灵敏度和特异性，与商品化单项PCR试剂盒检测结果完全一致。王隆柏等[11]建立了能同时扩增CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、PPV等5种病毒的多重PCR方法。结果显示，该法对CSFV、PRRSV、PRV、PCV2和PPV5种病毒的检测敏感性分别为220、1.6、72、400和370 pg，特异性结果显示，该法对SIV、JEV、SS、PEDV扩增结果均为阴性，特异性好。谢燕婷等[12]利用PRV gB基因、PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因的保守区进行引物设计，建立了PRV、PCV2、PPV多重PCR检测方法，该法对3种病毒的检测灵敏度分别为1.62×10-6、1.47×10-6和1.28×10-4ng，对PRRSV和CSFV的扩增结果均为阴性。顾阳等[13]根据猪伪狂犬病病毒（PRV）gE、gH基因序列，设计合成了2对特异性引物，通过对PCR扩增条件的优化，建立了鉴别PRV强毒和疫苗毒的双重PCR检测方法，即利用一次PCR反应，从强毒株基因组中可同时扩增出2条大小分别为429 bp(gE基因)，355 bp (gH基因)的特异性片段，从弱毒株DNA中仅扩增出1条大小为355 bp的片段，而猪圆环病毒2型和猪细小病毒 DNA扩增结果均为阴性。敏感性试验表明，所建立的双重PCR检测方法最低有效检测量为1×102TCID50/0.1 mL。王洪光等[14]建立了可同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型（PCV2）与猪细小病毒(PPV)的多重PCR方法，结果显示，扩增的目的片段大小分别为192 bp（PRV）、255 bp（PCV2）和759 bp（PPV）。对PRV、PCV2 和PPV的核酸检测最低浓度分别为：2.5×10-2、2.2×10-3和3.7×10-2ng。

5 荧光定量PCR方法

荧光定量PCR技术是指采用荧光探针或SYBR GreenⅠ荧光染料通过连续监测荧光信号强弱的变化来测定特异性产物的量，不需要分离PCR产物，即能准确定量起始模板数。且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等优点。吕素芳等[15]建立了检测伪狂犬病毒(PRV) gE基因缺失病毒株SYBR Green I实时定量PCR方法，该法的检测灵敏度为1.75×103拷贝/μL，比传统PCR方法高100倍，对PCV2、PPV、CSFV、PRRSV检测结果均为阴性，具有良好的特异性和重复性。郑敏等[16]建立了可区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，同时验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示，该法检测灵敏度为2.23×10拷贝/μL，比常规PCR检测方法高100倍，与PCV2、CSFV、PRRSV、PPV均无交叉反应，具有高特异性。余波等[17]建立了猪PRV SYBR Ureen I实时荧光定量PCR诊断方法，研制诊断试剂盒。扩增产物的熔解曲线分析结果显示只出现单特异峰，无引物二聚体，对猪PCV2、PPV、PRV gE基因缺失株、猪源E.coli、CSFV、PRRSV均无阳性信号扩增，且重复性好，灵敏度可达2.3×101拷贝/μL。田云等[18]根据伪狂犬病病毒gE基因的序列，设计和合成了一对特异的可用于检测伪狂犬病病毒野毒的PCR引物和一条Taqman。荧光探针，采用荧光定量PCR仪，建立了一种可实时定量检测伪狂犬病病毒野毒的荧光定量PCR技术。该方法的线性范围为1.0×102～1.0×1010拷贝，灵敏度可达4拷贝。对伪狂犬病gE基因缺失疫苗、猪细小病毒和鸭瘟病毒扩增结果均为阴性。郑兰兰等[19]建立了同时检测检测猪伪狂大病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法，结果显示，PCV2与PRV荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.8 ℃和86.7 ℃，熔解曲线特异，灵敏度分别可达215拷贝/μL 和180拷贝/μL，是普通PCR检测方法的100倍。

6 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增检测方法(LAMP)是一种新兴的分子生物学检测方法，已广泛应用于多种细菌病和病毒病的检测。以操作简单、检测速度快、敏感性好、特异性高等优势适合基层部门应用。杨睿等[20]根据PRV gE基因的保守序列，应用Primer Explorer V4软件，设计合成了一套LAMP引物，经过反应体系与反应时间的优化，建立了PRV的可视化LAMP快速检测方法。该方法最低可检测出质量浓度为6.2×10-9mg/L的病毒DNA含量，灵敏度为普通PCR的100倍，而且特异性好，能够区别伪狂犬病野毒与gE基因缺失疫苗毒。该方法反应快速，只需要40 min就能检测出结果，操作简单，不需要PC R仪等复杂的仪器，为伪狂犬病的快速诊断提供了新的思路。张莉等[21]针对猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计并合成了4条引物，建立了伪狂犬病病毒的环介导等温扩增检测方法，并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示，该方法可特异性地检测猪伪狂犬病病毒强毒株①，不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株，该方法的最低检测量可达100个拷贝质粒DNA，比常规PCR方法的敏感性高10倍。王树芬等[22]设计并合成3对LAMP引物，以罗丹明B衍生物作指示剂(该指示剂在反应前加到反应缓冲液里)，通过优化反应条件，建立了可视化LAMP快速检测PRV的方法，该法在63 ℃恒温反应40 min可得到肉眼可视结果，颜色变成蓝色判定为阳性，仍然保持紫色判定为阴性。

7 小结与展望

随着分子生物学的发展，各国专家、学者先后建立了多种PRV分子生物学检测方法，但这些方法各有优缺点，如常规PCR方法、套式PCR方法和多重PCR方法虽然检测简单、快速、方便但不能精确定量，且敏感性有限，容易漏检。荧光定量PCR技术弥补了常规PCR方法的缺点，但由于所用仪器和试剂价格昂贵，成本高，且对操作人员有很高的要求，不利于其在基层兽医部门大规模推广应用。LAMP方法是一种新兴的方法，不需要特殊的仪器设备，操作简便，但敏感性太高，易导致假阳性结果，且单独使用任何一种方法都很难正确诊断该病，最好将各种方法结合起来，综合判断，不同单位可根据自身的情况选择适合的方法，相信随着分子生物学的不断发展，将会有更多的新型分子生物学诊断方法建立，从而为猪伪狂犬病的诊断、分子流行病学调查和防控提供保障。

参考文献

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