益气解毒方水提物对RAW264.7细胞免疫功能的影响

廖　雪，蔺　婷，罗晶婧，田道法，廖端芳，曾　嵘，林丽美，何迎春

(1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中西结合学院，

湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410208)



益气解毒方水提物对RAW264.7细胞免疫功能的影响

廖雪1，蔺婷2，罗晶婧1，田道法2，廖端芳1，曾嵘1，林丽美1，何迎春3

(1.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中西结合学院，

湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410208)

[摘要]目的研究益气解毒方水提物对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞免疫功能的影响,并探讨其可能的作用机制。方法用不同浓度益气解毒方水提物处理RAW264.7细胞，MTT法检测细胞增殖活性，ELISA法检测细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-12(IL-12)、一氧化氮(NO)的分泌水平，Western blot法检测细胞核转录因子NF-κBp65蛋白的表达水平。结果与空白对照组比较，益气解毒方水提物在10～320 mg·L-1范围内明显促进RAW264.7细胞增殖，且10 mg·L-1浓度效果最佳(P<0.05)；与空白对照组比较，益气解毒方水提物能促进TNF-α、IL-12及NO的分泌(P<0.05)，显著诱导细胞内NF-κBp65蛋白的表达(P<0.05)。结论益气解毒方水提物对RAW264.7细胞的免疫功能具有调节作用，其作用可能与激活NF-κBp65蛋白通路相关。

[关键词]益气解毒方；RAW264.7细胞；免疫功能；鼻咽癌

巨噬细胞是组成机体免疫体系的重要免疫效应细胞之一，具有吞噬、代谢、产生细胞因子及抗肿瘤免疫等多种功能，在宿主防御机制及维持机体内环境等方面有重要作用[1-2]。巨噬细胞参与免疫应答的全过程，依靠内吞、抗原呈递作用和分泌细胞因子等途径在肿瘤免疫中发挥重要作用，其中，活化的巨噬细胞分泌的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)、白介素-12(interleukin-12，IL-12)、一氧化氮(nitric oxide，NO)等细胞因子直接参与巨噬细胞介导的杀伤肿瘤细胞的作用[3-6]。TNF-α能直接杀伤多种肿瘤细胞、提高中性粒细胞的吞噬能力及活化NK细胞发挥细胞毒作用；IL-12能诱导Th0细胞向Th1细胞分化，发挥免疫功能；高浓度的NO为主要的细胞毒效应分子，可杀伤原位肿瘤细胞，是介导巨噬细胞杀伤肿瘤的中心分子[6-8]。益气解毒方是本课题组研究和应用了20 a的经验方(经湖南省药监局批准，通过优良药房工作标准验收，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科生产)，该方对体内外鼻咽癌细胞均有较强的抑制作用，用于临床鼻咽癌的康复治疗、鼻咽癌前病变的治疗以及其他肿瘤和瘤样疾病的治疗，效果显著。益气解毒方抗鼻咽癌药理机制的研究，近年来主要集中在诱导肿瘤细胞凋亡、调控肿瘤细胞周期及逆转肿瘤细胞多药耐药性等方面[9-12]，关于益气解毒方对巨噬细胞免疫功能的影响研究较少。本实验将以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为研究对象，研究益气解毒方水提物对RAW264.7细胞增殖活性，TNF-α、IL-12及NO的分泌和核转录因子NF-κBp65表达水平的影响，旨在阐述益气解毒方水提物对RAW264.7细胞免疫功能的影响，为研究其抗鼻咽癌的药理机制提供新的思路。

1材料与方法

1.1细胞培养用含体积分数10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素和100 u·mL-1链霉素的DMEM高糖培养基培养RAW264.7细胞(购自中南大学湘雅中心实验室细胞库)。将细胞置于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养，每天换液，待细胞铺满培养瓶底90%后用消化液(含质量分数0.3%胰酶和质量分数0.05%乙二胺四乙酸)消化，12比例传代。

1.2益气解毒方水提物益气解毒方由黄芪(20 g)、党参(5 g)、天花粉(10 g)、黄连(5 g)、白花蛇色草(10 g)、茯苓(10 g)、甘草(3 g)等7味药组成，组方药药材来源为：黄连5 g/袋(产地四川，批号XH14121201，由湖南中医药大学第一附属医院提供)，茯苓10 g/袋(产地云南，批号JC15020201，由湖南中医药大学第一附属医院提供)，党参5 g/袋(产地甘肃，批号1410141042，由毫州市沪潐药业有限公司提供)，白花蛇色草10 g/袋(产地湖南，批号140701，由湖南南国药都中药饮片有限公司提供)，黄芪20 g/袋(产地内蒙古，批号CS15011901，由湖南中医药大学第一附属医院提供)，天花粉10 g/袋(产地河北，批号1412110362，由毫州市沪潐药业有限公司提供)，甘草3 g/袋(产地内蒙古，批号NG15012102，由湖南中医药大学第一附属医院提供)。20副益气解毒方药材经过鉴定，挑选、粉碎、过筛后，浸泡过夜，按固定配比加蒸馏水回流提取2次(第1次10倍量，第2次8倍量)，每次提取2 h，合并提取液，离心弃去沉淀后，上清液减压浓缩至小体积，于冷冻干燥器中干燥得水提物浸膏，浸膏得率为10.83%。益气解毒方水提物浸膏溶于一定量细胞培养基中，过滤除菌，-20 ℃分装保存。

1.3MTT法检测细胞活性MTT法检测细胞活性取96孔细胞培养板，以1×104/孔的数量加入对数生长期的RAW264.7细胞，次日对照组给予常规DMEM培养基，实验组加入不同体积的益气解毒方水提物，补充培养液至200 μL，使益气解毒方水提物的终浓度分别为10、20、40、80、160、320 mg·L-1，同时设脂多糖组(终浓度为1 mg·L-1)，每组5个复孔。在5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h后，吸去培养基，每孔加入100 μL 0.5 mg·mL-1MTT，上述相同条件下继续培养4 h，弃培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡溶解10 min，酶标仪570 nm波长检测吸光度(A)值，计算细胞相对增长率。细胞相对增殖率=(实验组A值-对照组A值)/对照组A值×100%。

1.4ELISA法检测细胞TNF-α、IL-12及NO分泌水平取96孔细胞培养板，以1×105/孔的数量加入对数生长期的RAW264.7细胞，实验处理同上，24 h后取上清液进行测定，每个实验组5个复孔，重复3次。TNF-α、IL-12和NO水平测定按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.5Western blot法检测细胞中NF-κBp65蛋白表达参照何迎春等[10]的方法进行。收集对照组、益气解毒方水提物24 h处理组(10、20、40、80、160、320 mg·L-1)、及脂多糖24 h处理组(1 mg·L-1)细胞，提取总蛋白并用BCA法检测蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳，湿转至PVDF膜后封闭，加入抗NF-κBp65(11 000)抗体，4 ℃过夜。加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h，ECL检测液发光显影定影，GADPH设为内参，Quantity One软件分析。

2结果

2.1益气解毒方水提物对RAW264.7细胞的活性影响各益气解毒方组RAW264.7细胞的增殖率显著高于空白对照组(P均<0.05)，说明益气解毒方水提物可促进RAW264.7细胞增殖，且10 mg·L-1浓度效果最佳。见表1。

表1　益气解毒方水提物对RAW264.7细胞增殖活性的影响

注：与空白对照组比较，1)P<0.05

2.2益气解毒方水提物对RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-12及NO的影响各益气解毒方组TNF-α、IL-12及NO表达水平显著高于空白对照组(P均<0.05)，说明益气解毒方水提物能刺激小鼠巨噬细胞分泌TNF-α、IL-12及NO，且浓度为10 mg·L-1即达到最佳效应值。见表2。

2.3益气解毒方水提物对RAW264.7细胞NF-κBp65蛋白表达的影响不同浓度益气解毒方水提物处理RAW264.7细胞24 h后，样品内参GADPH蛋白量表达基本不变的情况下，益气解毒方水提物能明显上调NF-κBp65蛋白的表达水平，灰度值与空白对照组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。见图1、2。

表2　益气解毒方水提物对RAW264.7细胞TNF-α、IL-12及NO分泌水平的影响

注：与空白对照组比较，1)P<0.05

图1　益气解毒方水提物作用于RAW264.7

3讨论

巨噬细胞是重要的分泌细胞之一，能产生100多种生物活性物质，其中TNF-α、IL-12、NO是主要的细胞毒效应分子，直接参与巨噬细胞介导的杀伤肿瘤细胞的作用[13]。NF-κB是一种细胞核转录因子，与肿瘤细胞的发生、增殖、分化、凋亡、侵袭和转移有密切关系，其调控的靶基因包括免疫相关受体、细胞因子(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α、NO、GM-CSF)、炎症因子(IL-8、MCP1)、黏附因子(ICAM、VCAM)、急性期蛋白(SAA)等，其中在哺乳动物细胞中常见的NF-κB家族成员为NF-κBp65蛋白[14]。在静止细胞中，NF-κB与NF-κBp65蛋白结合，使NF-κB以一种非活化的形式存在于细胞质中。当NF-κB信号通路被诸如药物、细胞因子、淋巴因子、紫外线、压力等外来因素激活后，NF-κBp65蛋白转位进入细胞核，一系列在免疫反应中发挥重要作用的细胞因子的基因表达也相应被激活[15]。

图2　益气解毒方水提物对

注：与空白对照组比较，1)P<0.05

本实验研究发现，益气解毒方水提物可调控RAW264.7细胞的免疫活性。MTT法实验结果表明益气解毒方水提物可显著促进细胞增殖；通过ELISA法检测发现益气解毒方水提物作用后，RAW264.7细胞TNF-α、IL-12及NO的分泌增加，表明益气解毒方水提物具有促进TNF-α、IL-12及NO分泌的作用；与此同时，益气解毒方水提物增加NF-κBp65蛋白的表达。研究结果提示，益气解毒方水提物可能是通过激活NF-κB信号通路，相应激活TNF-α、IL-12、NO等细胞因子的基因表达，从而促进TNF-α、IL-12、NO等细胞因子的分泌，增强巨噬细胞的免疫功能。这可能是益气解毒方发挥抗鼻咽癌作用的药理学机制之一。

参考文献：

[1]Xidakis C,Kolios G,Valatas V,et al.Effect of octreotide on apoptosis-related proteins in rat Kupffer cells:a possible anti-tumour mechanism[J].Anticancer Res,2004,24(2B):833-841.

[2]Naito M,Hasegawa G,Ebe Y,et al.Differentiation and function of Kupffer cells[J].Med Electron Microsc,2004,37(1):16-28.

[3]Paulnock DM.Macrophage activation by T cells[J].Curr Opin Immunol,1992,4(3):344-349.

[4]Klostergaard J.Macrophage tumoricidal mechanisms[J].Res Immunol,1993,144(4):274-276.

[5]Popov SV,Popova GY,Ovodova RG,et al.Effects of polysaccharides from Silene vulgaris on phagocytes[J].Int J Immunopharmacol,1999,21(9):617-624.

[6]朱建飞，唐春红，吴谋成.菜籽多糖WPS-1对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能的影响[J].中国粮油学报，2011,26(8)：41-44.

[7]蔡海兰，黄晓君，聂少平，等.铁皮石斛多糖对RAW264.7细胞分泌TNF-α的影响[J].中国药理学通报，2012,28(11)：1553-1556.

[8]Klostergaard J.Macrophage tumoricidal mechanisms[J].Res Immunol,1993,144(4):274-276.

[9]江洁琼，贺安意,田道法，等.益气解毒方对TgN(p53mt-LMP1)/HT转基因小鼠鼻腔和鼻咽黏膜上皮细胞增殖及凋亡相关基因表达的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2008,12(42)：8201-8205.

[10]吴新正，田道法，戴娜，等.益气解毒方对TgN(p53mt-LMP1)/HT小鼠鼻咽黏膜上皮细胞周期相关蛋白的影响[J].中国医药生物技术，2013,8(2)：119-124.

[11]刘湘，范婧莹，何迎春，等.益气解毒方干预鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤肿瘤微环境细胞免疫耐受现象的初步研究[J].中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志,2013,21(1):10-15.

[12]何迎春，陈艳，廖端芳，等.不同临床类型原发鼻咽癌组织差异表达蛋白[J].基础医学与临床，2012,32(12)：1778-1783.

[13]张莘莘,李文娟，聂少平，等.黑灵芝多糖对体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞功能的影响[J].中国药理学通报，2010,26(9)：1139-1142.

[14]Ghosh S,Karin M.Missing pieces in the NF-kappaB puzzle[J].Cell,2002，109 Suppl:S81-S96.

[15]Shin S,Kwon J,Lee S,et al.Immunostimulatory Effects of Cordyceps militaris on Macrophages through the Enhanced Production of Cytokines via the Activation of NF-kappaB[J].Immune Netw,2010,10(2):55-63.

Immunomodulating Effects of Yiqijiedu Formula on RAW264.7 Cells

Liao Xue1,Lin Ting2,Luo Jingqian1,Tian Daofa2,Liao Duanfang1,Zeng Rong1,Lin Limei1,He Yingchun3

(1.SchoolofPharmacy,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China；2.Schoolofthe

IntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208,

China；3.SchoolofMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the immunomodulating effects of yiqijiedu formula on RAW264.7 cells and its possible mechanisms.MethodsRAW264.7 cells were treated with different concentrations of yiqijiedu formula,cell proliferation was measured by MTT assay; concentration of tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-12(IL-12)and nitric oxide(NO)were determined by ELISA method; production of NF-κBp65 protein was detected by Western blot.ResultsYiqijiedu formula(10-320 mg·L-1)possessed the stimulation effect on macrophages proliferation in a dose-dependent manner(P<0.05); the production of TNF-α,IL-12 and NO were increased in a dose-dependent manner when pretreated with yiqijiedu formula(P<0.05); the expression level of NF-κBp65 was significantly increased after yiqijiedu formula treatment(P<0.05).ConclusionYiqijiedu formula could enhance the immune regulation of RAW264.7 cells,which may be related to the activation of NF-κBp65 pathway.

[Key words]yiqijiedu formula; raw264.7 cells; immune function; nasopharyngeal carcinoma

收稿日期：(2015-10-28)

[中图分类号]R739.63;R73-36

[文献标识码]A

[文章编号]1673-5412(2015)06-0473-04

通信作者：何迎春(1972-)，女，博士，博士生导师，主要从事中西医结合防治肿瘤及其机制研究。E-mail：1305851329@qq.com

作者简介：廖雪(1990-)，女，硕士，主要从事中药防治肿瘤及其机制研究。E-mail：243361268@qq.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：81273988、81573721)；中国博士后科学基金资助项目(编号：2011M501277)；湖南省科技厅计划项目(编号：2014FJ3021)；湖南省十二五中医五官重点学科资助项目(编号：61078074)

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.06.004