p300 RNA干扰慢病毒载体的构建及其在CNE-2细胞中的表达

廖志伟，罗键雄，喻　芳，余宏伟，庄雅靖，周同冲，刘孟忠

(1.广州医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510095；

2.中山大学肿瘤防治中心放疗科，广东 广州 510060；3.广州医科大学第三临床学院，广东 广州 510180)



p300 RNA干扰慢病毒载体的构建及其在CNE-2细胞中的表达

廖志伟1,2，罗键雄3，喻芳1，余宏伟1，庄雅靖1，周同冲1，刘孟忠2

(1.广州医科大学附属肿瘤医院，广东 广州 510095；

2.中山大学肿瘤防治中心放疗科，广东 广州 510060；3.广州医科大学第三临床学院，广东 广州 510180)

[摘要]目的构建p300基因RNA干扰慢病毒载体获得稳定感染的人鼻咽癌CNE-2细胞株，以观察CNE-2细胞中p300的表达及其功能。方法设计p300基因特异性RNA干扰靶序列，与经HpaI和XhoI酶切后的载体连接，产生重组慢病毒质粒pLL-GFP-Puro-shp300，筛选阳性克隆，测序鉴定，与慢病毒包装载体共转染293T细胞，包装产生慢病毒，对病毒滴度和感染效率进行检测。结果pLL-GFP-Puro-shp300慢病毒RNA干扰载体经酶切和测序鉴定证实准确连接测序正确，且包装出来的病毒纯化后滴度达107TU·mL-1。RT-qPCR、Western blot结果显示感染后p300 mRNA及蛋白水平显著下降，证明重组慢病毒对CNE-2细胞p300基因表达有明显沉默作用。结论成功构建靶向p300基因RNA干扰慢病毒载体，为进一步研究p300在鼻咽癌发生过程中的作用奠定基础。

[关键词]p300；鼻咽癌；慢病毒载体

p300是人体重要的乙酰基转移酶，在食管癌[1]、肝癌[2]、乳腺癌[3]、结直肠癌[4]等恶性肿瘤组织中表达明显增高，提示p300在肿瘤的形成、增殖、转移中起重要作用。为进一步明确p300在鼻咽癌转移中的作用，本研究尝试构建针对p300的RNA干扰慢病毒载体并检测其感染效率，为进一步研究p300在鼻咽癌发生过程中的作用奠定基础，旨在探讨其作为靶向治疗的可能性。

1材料与方法

1.1主要实验材料及试剂人鼻咽癌细胞株CNE-2购自中山大学细胞库，293T细胞购自美国ATCC细胞库，细胞培养及保存于广州永诺生物科技有限公司。慢病毒载体及包装系统pLL3.7-GFP-Puro质粒、pMD2.G(VSVG)质粒、pMDLg/pRRE质粒、pRSV-Rev质粒均购自广州永诺生物科技有限公司。限制性内切酶HpaI及XhoI购自美国NEB公司。质粒大提试剂盒购自德国QIAGEN公司。高纯质粒小量提取试剂盒和Tran5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。Opti-MEM培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清及Lipofectamine 2000均购自美国Gibco公司。

1.2方法

1.2.1慢病毒载体构建根据GenBank注册的p300(NM_001429.3)序列，利用Promega、Dharmaco和Invitrogen公司提供的RNA靶序列分析设计软件，结合siRNA靶序列设计原则，依据茎环结构的特点，分别合成2对shRNA单链，两端加上HpaI和XhoI限制性内切酶位点。设计好的序列送至上海捷瑞生物工程有限公司合成。合成相应的DNA单链，退火形成具有黏性末端的DNA双链，与经过HpaI和XhoI双酶切的线性化pLL3.7-GFP-Puro载体连接。连接产物转化至Tran5α感受态细胞中，菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，37 ℃培养过夜。选取阳性克隆，质粒小提，用HpaI和XhoI双酶切电泳鉴定提取的质粒，酶切鉴定正确的质粒送测序。经QIAGEN试剂盒大提测序正确的质粒后低温保存。针对p300的编码序列设计的干扰序列如下：Sip300-1：5’-AACTGCACAAATGTCTAGTTCTTTTCAAGAGAAAGAACTAGACATTTGT-GCTTTTTTC-3’；3’-TTGACTCTTCTCCCTCAGATATAAAGTTCTCTTTCTTGATCTGTAAACACGAAAAAAGAG-CT-5’。Sip300-2：5’-AACTCCCCTCCTCTTCAGCACCATT-CAAGAGATGGTGCTGAAGAGGAGGGGTTTTTTC-3’；3’-TTGAGGGGAGGAGAAGTCGTGGTAAGTTCTCTACCACGA-CTTCTCCTCCCCAAAAAAGAGCT-5’。

1.2.2慢病毒包装转染前以无抗生素的培养基培养293T细胞，待细胞融合度达到70%~80%时，将pLL3.7-GFP-Puro-shp300载体，pMDLg/pRRE载体、pRSV-ReV载体、pMD2.G(VSVG)载体包装混合液与相应体积的Opti-MEM培养基混合，然后加入Lipofectamine 2000，室温下温育20 min形成DNA与Lipofectamine 2000的转染复合物。将转染复合物加入含293T细胞的培养基中，于37 ℃、体积分数5% CO2细胞培养箱中培养6 h后，更换新鲜培养基10 mL，再继续培养72 h后收集293T细胞上清液，离心、过滤取病毒浓缩液。分装后将病毒浓缩液-80 ℃保存于病毒管中。

1.2.3慢病毒滴度测定将293T细胞以4×104个细胞/孔的密度接种于96孔板，慢病毒液按10倍浓度稀释5个浓度，将梯度稀释的含病毒培养基加入各孔中，病毒感染的同时加入polybrene以增加感染效率。经逐孔稀释及荧光共聚焦检测病毒滴度。病毒滴度(TU·mL-1)=GFP阳性细胞率×细胞总数/(慢病毒液体积×慢病毒稀释倍数)

1.2.4低表达p300 CNE-2细胞株的建立复苏CNE-2细胞接种于6孔板，采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37 ℃的CO2培养箱中培养。按照MOI=10，用慢病毒液转染CNE-2细胞，感染后第2天，吸去含病毒的培养基，换上新鲜的完全培养基，继续37 ℃培养，荧光显微镜观察GFP表达情况。感染后，换上含适当浓度的Puromycin的新鲜完全培养基，筛选稳定转导的细胞株。

1.2.5RT-qPCR收集转染细胞，采用Trizol法一步提取总RNA。用M-MLV Reverse Transcriptase (美国Promega公司)进行逆转录反应。注：反应体积包括：引物、GoTaq®qPCR Master Mix、DNA模板加至总体积20 μL。将反应管置于MiniOpticonTMRT-qPCR反应仪。PCR反应程序参照说明书进行。荧光实时定量PCR法检测p300的表达。选取GAPDH做内参,采用2-ΔΔCt法计算p300相对表达量。以GAPDH为内参的目的基因引物设计见表1。

表1　以GAPDH为内参的目的基因引物设计情况

1.2.6Western Blot检测p300蛋白表达收集各组细胞，裂解液裂解细胞后提取总蛋白。Bradford方法定量后进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后转膜。放置质量分数5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭2 h。一抗(p300，美国Santa Cruz公司，sc-584)4 ℃过夜，TBS冲洗。用相应的稀释好的二抗(HRP标记二抗，广州永诺生物科技有限公司)37 ℃封闭1 h。ECL法显色，曝光成像。以GAPDH(cst2118,11 000)作为内参照。通过观察电泳条带的深浅强度判断p300蛋白的表达水平。

2结果

2.1p300慢病毒干扰表达载体的酶切鉴定和测序体外合成的寡核苷酸上游单链和下游单链在体外退火后形成双链DNA，与pLL3.7载体链接。连接产物转化Tran5α感受态细胞中。 用含氨苄青霉素(100 μg·mL-1)的LB平板筛选阳性克隆质粒，分别挑取4个菌落加入含有相应抗生素的LB培养基中过夜培养，用高纯质粒小量提取试剂盒小提质粒。经HpaI和XhoI酶切电泳鉴定所提取质粒。shp300-1质粒酶切电泳结果显示：泳道1、2、4是连接成功的shp300-1，而泳道3表示连接未成功。shp300-2质粒酶切电泳结果显示：泳道1、2、3、4是连接成功的shp300-2(图1)。shp300-1和shp300-2分别挑1个(取1号)送中美泰和公司进一步测序验证。

图1　shp300-1和shp300-2酶切鉴定图

DNA测序结果中显示shRNA片段已成功插入到pLL3.7-GFP-Puro载体，说明成功构建针对p300基因的RNA干扰重组质粒pLL-GFP-Puro-shp300-1和pLL-GFP-Puro-shp300-2，对阳性克隆进一步扩增菌液提质粒用于病毒包装。

2.2慢病毒载体感染293T细胞株以及慢病毒的包装和滴度测定当293T细胞的生长状态达到产生慢病毒实验的要求时，将p300干扰质粒、慢病毒包装辅助质粒共转染293T细胞。转染48 h后可见较强亮度的片状绿色荧光，同时可见部分293T细胞从培养皿壁上脱落下来，漂浮在细胞培养基中，说明有部分293T细胞开始裂解并释放病毒到细胞培养基中。

本研究采用孔稀释法检测慢病毒滴度，第1个管中加入待测定的病毒原液10 μL，记为1E+1 μL；混匀后，取10 μL加入到第2个管中，记为1E+0 μL。重复以上操作直到最后1管。通过荧光显微镜观察GFP荧光表达，1E+1组几乎所有细胞表达GFP荧光，荧光细胞比例随病毒稀释而减少。在最后一个浓度1E-4 μL组的孔中可观察到4个带有荧光的细胞，说明该孔至少有4个病毒颗粒感染细胞，经过计算LV-shp300-1生产的病毒液滴度达到4.0×107TU·mL-1，同样的方法测得LV-shp300-2生产的病毒液滴度达到5.0×107TU·mL-1(图2)。收集病毒原液备用。进行下一步RT-qPCR和Western Blot验证干扰效果。

图2　不同浓度的慢病毒感染

2.3重组慢病毒对CNE-2细胞p300基因表达及蛋白表达的影响利用合成的shp300-1和shp300-2病毒液分别感染CNE-2细胞，感染3 d后可在荧光显微镜下观察到GFP的表达，进一步用Puromycin筛选1周后，镜下可见NC组和2个shp300组出现密集荧光细胞，提示慢病毒载体系统有效转导进入CNE-2细胞，并且感染率高于95%。

为了明确CNE-2细胞感染pLL3.7-GFP-shp300后p300蛋白的变化，我们首先利用Western blot研究了pLL3.7-GFP-shP300-1、pLL3.7-GFP-shP300-2对CNE-2中p300蛋白水平抑制作用。各组中GAPDH的表达量基本相同，差异无统计学意义(P>0.05)。pLL3.7-GFP-shP300-1和pLL3.7-GFP-shP300 -2组p300蛋白的表达量都有所降低。见图3。

图3　Western Blot检测p300蛋白的表达情况

由于pLL3.7-GFP-shp300-1组干扰效果较好，所以进一步选用pLL3.7-GFP-shp300-1组进行RT-qPCR检测p300的mRNA水平。结果发现，与NC组相比，pLL3.7-GFP-shp300 -1慢病毒感染细胞后p300的mRNA明显下降(1.2±0.2vs0.3±0.1)，差异有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

组蛋白乙酰化是一种重要的表观遗传修饰方式，p300是一种能与腺病毒癌蛋白E1A相互作用的有多结构域的大分子蛋白质,其相对分子质量为300 000。p300作为组蛋白乙酰转移酶，能乙酰化4种核心组蛋白，削弱DNA与组蛋白之间以及2个核小体之间的相互作用，从而破坏高度有序的染色质结构，使转录因子易于与DNA结合，使RNA聚合酶Ⅱ能顺利通过核小体阵列，从而促进转录。p300与恶性肿瘤发生有密切关系,在细胞周期调控、细胞分化和细胞凋亡等多种生理过程中发挥着重要作用[5-6]。p300被发现在多种肿瘤中高表达，如黑色素瘤[7]、乳腺癌[3]、肺癌[8]、肝癌[2]和食管癌[1]等。我们前期的研究[9]发现，p300的mRNA及蛋白水平在鼻咽癌组织中较正常鼻咽黏膜组织明显升高，进一步研究发现p300过表达与鼻咽癌患者的淋巴结转移、临床分期密切相关，p300上调患者 5 a 生存率及无进展生存率明显下调[9]。尽管今年来调强放疗技术联合化疗提高了鼻咽癌的肿瘤控制率并改善患者的生存状况[10]，但局部复发及远处转移仍是其治疗失败主要原因。进一步明确p300在鼻咽癌发生、发展中的功能及其分子机制将有助于发展鼻咽癌新的治疗措施，从而进一步提高患者生存率。

目前基因功能的鉴定，通常使用gain-of-function和loss-of-function，即分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和基因敲除,从表型分析该基因的功能。上调或下调p300基因的表达，必须首先获得p300过表达和p300稳定干扰的细胞表型。RNA干扰技术是基因沉默有力工具，已成为分子生物学研究主要技术手段之一。通过RNA干扰技术导致同源mRNA降解，从而选择性抑制相关基因的表达。质粒介导RNA干扰有局限性，由于基因抑制表达作用弱、持续时间短，无法保证基因的转染效率，不适合体内实验。慢病毒载体是当今基因治疗载体的热点，能够提供高效的基因转移，表达稳定，可操控性强[11-12]。本研究采用三质粒包装系统确保慢病毒载体系统安全性，该系统包括转移质粒，包装质粒和包膜质粒。病毒感染目的细胞不会再感染其他细胞，不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒介导RNA干扰能在哺乳动物细胞内稳定表达siRNA，可以长期抑制基因表达。

利用慢病毒载体抑制鼻咽癌CNE-2细胞的p300表达未见报道，本研究针对p300基因设计2个特异性siRNA靶序列，成功构建以GFP为报告基因的p300 shRNA慢病毒载体，经酶切和测序显示载体构建成功。利用慢病毒载体pLL3.7-GFP-Puro介导shp300感染鼻咽癌CNE-2细胞，结果显示，慢病毒可高效稳定的转入鼻咽癌CNE-2细胞，转导效率高于95%。结果发现shp300-1的干扰效率最高，其明显下调CNE-2细胞p300 mRNA和蛋白的表达。病毒滴度可以反映病毒感染靶细胞的能力及效率，是评价包装细胞分泌感染性病毒颗粒的主要指标。本研究包装的慢病毒滴度达107TU·mL-1，进一步浓缩纯化后可以满足体内外实验的要求，为下一步动物活体RNA干扰实验奠定了基础。

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Construction of a Lentivirus Interfering Vector Carrying p300

Gene with RNA Interfering and Its Expression in the CNE-2 Cells

Liao Zhiwei1,2,Luo Jianxiong3，Yu Fang1，Yu Hongwei1,Zhuang Yajing1，Zhou Tongchong1，Liu Mengzhong2

(1.DepartmentofRadiationOncology,theTumourHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalUniversity,

Guangzhou510095,China;2.DepartmentofRadiationOncology,CancerCenter,SunYat-senUniversity,

Guangzhou510060,China;3.TheThirdClinicalCollegeofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510180,China)

[Abstract]ObjectiveTo construct a lentiviral vector carrying p300 gene with RNA interfering,and to establish human nasopharyngeal carcinoma cells with stably inhibited p300.MethodsTwo pairs of small hairpin RNA specific for p300 were designed,synthesized and cloned into the pLL3.7-GFP-Puro vector.Then,the lentivirual plasmid was transfected with the other two packaging plasmids into 293T cells to product and amplify lentivirus.After the infection of lentivirus mediated siRNA-p300,the mRNA and protein expression of p300 were observed.ResultsThe lentivirus vector of siRNA-p300 was constructed successfully.The virus titres were above 107TU·mL-1.pLL-GFP-Puro-shp300 was effective to inhibit p300 expression in mRNA and protein levels of CNE-2 cells.ConclusionA lentiviral vector carrying p300 gene with RNA interfering is successfully constructed.This study lays a foundation for further study of mechanisms of p300 in the nasopharyngeal carcinoma.

[Key words]p300; nasopharyngeal carcinoma; lentiviral vector

收稿日期：(2015-03-30)

[中图分类号]R739.63；R730.23

[文献标识码]A

[文章编号]1673-5412(2015)06-0464-05

作者简介：廖志伟(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事肿瘤放疗研究。E-mail:liaozhiwei1110@163.com

基金项目：广州医科大学大学生科技创新项目(编号：2013A002)；广州市医药卫生科技项目(编号：20141A011092)

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.06.002