CRMP2可通过改善神经细胞凋亡减轻缺血/再灌注大鼠神经功能缺损

幸享凤，王恬竹，秦新月

(重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆市神经病学重点实验室，重庆　400016)



CRMP2可通过改善神经细胞凋亡减轻缺血/再灌注大鼠神经功能缺损

幸享凤，王恬竹，秦新月

(重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆市神经病学重点实验室，重庆400016)

摘要：目的探讨CRMP2(collapsin response mediator protein 2)对大鼠脑缺血/再灌注损伤后神经细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法192只♂成年SD大鼠分成4组：假手术组(sham)、脑缺血/再灌注组(MCAO)、脑缺血+质粒对照组(MCAO+GFP)、脑缺血+CRMP2真核质粒干预组(MCAO+CRMP2/GFP)。大鼠MCA阻塞手术前1 d将真核质粒注射入脑内，缺血/再灌注后48 h、1周，采用RT-PCR检测各组大鼠脑组织CRMP2、BCL2、p53、Caspase-3和Caspase-8的mRNA的表达；Western blot检测脑组织CRMP2蛋白的表达；TUNEL染色检测凋亡细胞；免疫组化检测脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)的表达；TTC染色检测脑梗死体积并进行神经功能缺损评分。结果脑缺血/再灌注48 h及1周，与sham组比较，MCAO组及MCAO+GFP组CRMP2和BCL2的表达水平明显降低(P<0.01)，而Caspase-3、Caspase-8及p53的mRNA表达升高(P<0.01)，TUNEL阳性细胞数量明显升高(P<0.01)。MCAO+CRMP2/GFP组CRMP2和BCL2较MCAO及MCAO+GFP组明显增高(P<0.01)，同时该组p53、Caspase-3及Caspase-8表达明显降低(P<0.01)。过表达CRMP2使TUNEL阳性细胞数明显减少(P<0.01)。脑缺血/再灌注后BDNF表达升高(P<0.01)，而脑内过表达CRMP2使BDNF的水平上调更明显(P<0.01)。TTC染色显示，MCAO+CRMP2/GFP组脑梗死体积较MCAO组及MCAO+GFP组明显减小(P<0.01)，且神经功能缺损明显减轻(P<0.01)。结论过表达CRMP2可能通过对线粒体凋亡通路的调控减少了脑缺血/再灌注损伤后的神经细胞凋亡、减少脑梗死体积而起到神经保护作用。

关键词:CRMP2；脑缺血/再灌注；BDNF；凋亡；神经功能评分；TUNEL

缺血性脑损伤的病理过程极其复杂，其发病机制涉及脑组织能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、氧化应激损伤、炎症反应等诸多环节。最后，由于激活细胞凋亡基因导致细胞程序性死亡，使缺血半暗带区及梗死区融合。已经证实，在MCAO模型中，线粒体p53可通过转录依赖的机制来激活细胞的凋亡[1]。此外，脑缺血时钙离子在细胞内的大量聚集，引起大量兴奋性氨基酸及神经递质的释放，并且会激活大量的磷酸化酶，例如凋亡蛋白酶(caspase)[2]，加速了神经细胞的凋亡。

CRMP2(collapsin response mediator protein 2)是胞质磷酸化蛋白CRMP1-5家族成员之一，可参与调解多种神经生理活动，如：微管动力学、轴突出芽及回缩、神经分化、树突/轴突特化、依赖驱动蛋白的轴突转运、钙离子内态稳定性、神经介质释放等[3-5]。研究证实，CRMP2可抑制凋亡前体基因p53的表达，调节Sema3A诱导的细胞凋亡[6-7]。它还可调节NMDA受体的功能，与N型电压门控钙离子通道的α1B亚单位相互作用，稳定了钙离子内流[8-9]。因此，我们推测CRMP2可能是一个通过调控凋亡反应起到脑缺血后神经保护作用的蛋白。

本实验采用立体定位方式向颅内注射CRMP2真核表达质粒，使大鼠缺血侧脑组织过表达CRMP2，再进一步观察CRMP2对大鼠缺血/再灌注损伤后神经细胞凋亡及神经功能的影响。

1材料与方法

1.1实验动物及材料Sprague-Dawley ♂大鼠192 只(重医大动物实验中心提供)，体质量220～270 g，(20～25) ℃室温饲养，自然进水和食物。RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；兔抗CRMP2(美国CST)；山羊抗兔二抗(Proteintech Group, Inc)；TTC(美国Sigma)；兔抗BDNF(美国Abcam)；山羊抗兔二抗试剂盒(博士德)。

1.2方法

1.2.1真核表达质粒立体定位注射右侧侧脑室注射：以前囟为坐标0点，向右1.5 mm，向后1.2 mm，深4.5 mm。将带有GFP的空白质粒、真核表达质粒(160 mg·L-1)注射至大鼠侧脑室内，一次注射总量为4 μL，速度为0.3 μL·min-1，留针5 min。

1.2.2MCAO/再灌注模型制作与分组采用随机数字的方法将192只大鼠随机分为sham组、MCAO组、MCAO+GFP组、MCAO+CRMP2/GFP组,每组6只。脑立体定位注射后1 d，参照本课题组前期的实验方法[10]，采用Longa评分，1～3分的模型纳入实验，其余剔除，并从同批次实验模型大鼠中随机补齐。

1.2.3Western blot检测将各组大鼠脑缺血区域皮质取下，液氮速冻，-80 ℃保存。参照碧云天蛋白提取试剂盒提取蛋白用于检测。蛋白样品在浓度分数为0.1的SDS-PAGE凝胶中分离并转移至0.45的PVDF膜上，浓度分数为0.05的脱脂奶粉封闭90 min，CRMP2(55～65 ku)一抗(1 ∶1 000)4 ℃过夜，山羊抗兔二抗(1 ∶2 000)37 ℃孵育1 h，采用fusion软件检测与分析。

1.2.4RT-PCR检测灭酶器械取组织标本，参照RNA提取及逆转录试剂盒说明书处理得组织cDNA,-80 ℃保存。引物序列如下：CRMP2上游(21 bp)5′-TCCGGTCTGTTCTGGCTTTTTC-3′，下游(21 bp)：5′-AGGGTCCGCTCAGGCTGTGTC-3′; p53上游(19 bp)5′-CTGGACGACAGGCAGACTT-3′，下游(19 bp)5′-CAGCGTGATGATGGTAAGGA-3′；BCL2上游(19 bp)5′-GGTGGACAACATCGCTCT-3′，下游(20 bp) 5′-CAGCCAGGAGAAATCAAACA-3′；Caspase-3上游(20 bp) 5′-AAAGGAATGACTGGGAGTGG-3′，下游(20 bp)5′-AATGACGACCTGGAACATCG-3′，Caspase-8上游(20 bp)5′-AGCCCA TCTTCACACTACGG-3′，下游(22 bp)5′-AGCACACATCAGTTAGGACACA-3′。用SYBR GREEN进行扩增反应。

1.2.5免疫组化及TUNEL染色各组大鼠缺血/再灌注后48 h及1周，PBS加多聚甲醛(体积分数0.04)经升主动脉灌注取脑，固定24 h，脱水，冰冻切片(10 μm/片)。切片微波修复后进行BDNF一抗及相应的二抗孵育，中性树胶封片；用于检测TUNEL的组织，固定脱水后石蜡包埋切片，切片脱蜡后按照TUNEL染色试剂盒说明书进行染色，中性树胶封片。光镜400倍下，每个脑组织随机选取3个脑片，每个脑片的缺血半暗带随机选取5个区域，计算平均数。

1.2.6TTC染色及神经功能评分各组大鼠缺血/再灌注48 h后断头取脑，脑组织纵向切成2 mm厚度的脑片，TTC浸泡染色20 min，拍照，软件分析脑梗死体积百分比。神经功能评估采用评分者单盲的方法，参照Garcia[10]的评分标准进行评分，最低3分，最高18分，得分越低表示神经功能缺损越严重。

2结果

2.1脑缺血/再灌注后各组大鼠CRMP2 mRNA及蛋白的表达脑缺血/再灌注48 h及1周后，检测CRMP2的表达，结果提示：缺血/再灌注48 h CRMP2的表达较假手术组降低(P<0.01)，1周后CRMP2的表达较48 h时降低更明显(P<0.01)。真核表达质粒使缺血侧脑组织CRMP2的表达在两个时间点均明显上调，与MCAO和MCAO+GFP组比较差异具有统计学意义(P<0.01)(Fig 1)。

2.2过表达CRMP2对神经细胞凋亡的影响

2.2.1缺血/再灌注48 h和1周各组大鼠p53、Caspase-3、Caspase-8及BCL2 mRNA的表达脑缺血/再灌注48 h及1周，与sham组比较，缺血/再灌注后BCL2的mRNA的表达水平明显降低(P<0.01)，而同时Caspase-3、Caspase-8以及p53的mRNA表达升高(P<0.01)；与MCAO及MCAO+GFP组比，真核质粒干预脑缺血组织后升高了BCL2的mRNA水平(P<0.01)，同时明显降低了p53、Caspase-3、Caspase-8的mRNA水平(P<0.01)(Fig 2)。

2.2.2TUNEL染色观察凋亡细胞在假手术组，缺血侧皮质有少量的凋亡细胞，而在缺血/再灌注48 h后，可见有大量的TUNEL阳性细胞存在。与MCAO及MCAO+GFP组比较，给予过表达CRMP2干预后，该部位TUNEL阳性细胞有所减少(P<0.01)(Fig 3)。

2.3过表达CRMP2使BDNF表达升高大鼠缺血/再灌注之后48 h及1周，各组BDNF的表达均较假手术组升高(P<0.01)；过表达CRMP2使该组BDNF的表达较另外两组明显升高(P<0.01)(Fig 4)。

2.4过表达CRMP2对脑梗死体积及神经功能的影响再灌注后48 h，MCAO组及MCAO+GFP组大鼠缺血侧可见明显的梗死灶，并伴有严重的神经功能缺损(P<0.01)；真核质粒干预后梗死灶明显缩小(P<0.01)，神经功能缺损明显减轻(P<0.01)。

A～B:Western blot assay of CRMP2 expression. C:The bar graph reflected CRMP2 mRNA expression;**P<0.01vssham group;##P<0.01vsMCAO+CRMP2/GFP group;△△P<0.01vsMCAO group;1：sham group；2：MCAO group；3：MCAO+GFP group；4：MCAO+CRMP2/GFP group

1周后，缺血各组大鼠的神经功能均有所恢复，但MCAO+CRMP2/GFP组的神经功能评分明显高于其他两组(P<0.01)(Fig 5、Tab1)。

3讨论

脑缺血或者脑缺血/再灌注损伤的病理过程极为复杂，包括兴奋性氨基酸毒性、离子不平衡、氧化应激、炎症反应、自噬、凋亡及细胞坏死等[11]。研究证实，细胞程序性死亡在大鼠局灶性脑缺血的病理生理过程有重要的作用，导致大量神经细胞及传导束的损害[12]。脑缺血后大量神经细胞死亡，对神经功能产生严重的不良影响，而缺血半暗带区大部分神经细胞死亡以凋亡为主[13]。

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsMCAO+CRMP2/GFP group;△△P<0.01vsMCAO group

大鼠脑缺血之后神经细胞的死亡通过坏死和凋亡两种机制进行[14]。在各种应激及损伤的情况下，线粒体内膜损伤释放出细胞色素C启动内源性线粒体凋亡通路，细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子结合，可促进Caspase-9 前体的自身活化，之后激活Caspase-3 前体，从而导致DNA降解，同时破坏维持细胞的完整性的必需物质[15]。线粒体凋亡途径也可以通过激活细胞膜表面死亡配体[16]，如干扰素，诱导TNF 相关凋亡诱导配体和Fas/FasL引起Fas相关死亡结构域蛋白的激活，后者依次激活Caspase-8 及下游的Caspase 家族[17]，Caspase-8 的激活使Bid裂开，导致线粒体膜电位瓦解并引起细胞凋亡[18]。本实验研究发现，脑缺血/再灌注后48 h及1周，过表达CRMP2使缺血侧脑皮质BCL2表达升高，而Caspase-3、Caspase-8及p53的表达降低。此外，过表达CRMP2使TUNEL阳性细胞减少，减少了脑梗死体积，并更大程度的减轻了神经功能的缺损。研究表明，p53能上调BAX并下调BCL2[15]，而脑缺血组织中BCL2的表达升高可以调节线粒体膜上钙离子的内流，维持线粒体膜的完整性及调控氧化应激反应，从而改善细胞凋亡。因此，我们推测CRMP2可以通过调节内源性线粒体通路调控细胞凋亡。

同时，本实验还显示，CRMP2的过表达上调了BDNF的表达。已有研究证实，通过Slp1/Rab27B/CRMP-2/Kinesin-1通路募集TrkB传送到轴突终端是BDNF信号传输的关键[19]。BDNF可通过依赖ERK方式激活转录因子CREB和NFκB，从而增加抗凋亡基因Bcl2家族的表达，另一方面，BDNF可激活PKC，进一步调节GSK3的磷酸化。而GSK3的磷酸化是细胞存活还是死亡的重要平衡因子[20]。从而，我们推测CRMP2可能通过调节BDNF/CREB通路及BDNF/PLC/PKC/GSK3通路来影响细胞凋亡。此外，大量的钙离子在细胞内聚集，将激活凋亡蛋白酶(Caspase)，引起细胞凋亡[15]。钙离子的内流受NMDA受体调控，而CRMP2又可调节NMDA受体的功能[8-9]。因此，我们还推测，CRMP2通过BDNF/NMDA通路调节细胞内钙离子的内流，参与了对细胞凋亡的调控。这些假设将在后续的试验中进行论证。

A～D:The bar graph reflected p53,BCL2,Caspase-8 and Caspase-3 mRNA expression.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsMCAO+CRMP2/GFP group;△△P<0.01vsMCAO group. The bar graph refiected the expression of p53mRNA(A), BCl2 mRNA(B) Caspase-8 (C) and Caspase-3(D)

The black arrow for TUNEL positive cells.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsMCAO+CRMP2/GFP group;△△P<0.01vsMCAO group

The black arrow for BDNF positive cells.**P<0.01vssham group；##P<0.01vsMCAO+CRMP2/GFP group；△△P<0.01vsMCAO group

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsMCAO+CRMP2/GFP group

综上所述，过表达CRMP2能够减轻脑缺血/再灌注损伤后脑组织神经细胞的凋亡反应，缩小脑缺血/再灌注后的脑梗死体积，促进神经功能的恢复。这可能与CRMP2参与调节内源性线粒体凋亡通路及BDNF相关通路(如CRMP2/BDNF/CREB、CRMP2/BDNF/PLC/PKC/GSK3以及CRMP2/BDNF/NMDA)有关。本课题组拟在今后的研究中继续探索CRMP2的神经保护作用并证实相关机制。

(致谢：本文实验在重庆医科大学神经病学重点实验室完成，在此表示感谢！)

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CRMP2 alleviates neurological deficit by reducing neuron apoptosis in rats after cerebral ischemia/reperfusion injury

XING Xiang-feng，WANG Tian-zhu，QIN Xin-yue

(DeptofNeurology，theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,ChongqingKeyLaboratoryofNeurology,Chongqing400016,China)

Key words:CRMP2；cerebral ischemia/reperfusion；BDNF；apoptosis；neurological score；TUNEL

Abstract:AimTo investigate the influence of the overexpression of CRMP2 on neural cell apoptosis after ischemia reperfusion injury in rats and its possible mechanism.MethodsA total of 192 male adult SD rats were divided into four groups: sham group, cerebral ischemia/reperfusion group(MCAO group), cerebral ischemia with blank plasmid control group(MCAO+GFP group), cerebral ischemia with CRMP2 eukaryotic plasmid group(MCAO+CRMP2/GFP group). One day after injecting eukaryotic plasmid, the rats were operated for 120-min ischemia through MCA occlusion and reperfused. At 48 h and 1 wk, the expression of CRMP2, p53, Caspase-3, Caspase-8 and BCL2 in brain tissue was tested by RT-PCR and Western blot. Apoptotic cells were observed by TUNEL test. TTC staining was use to detect cerebral infarction volume. The neural function of the rats were also evaluated.ResultsCompared with the sham group, the expression levels of CRMP2 and BCL2 in MCAO group and MCAO+GFP group were significantly decreased(P<0.01), while p53, Caspase-3,Caspase-8 and TUNEL positive cells were elevated(P<0.01). Intervention of CRMP2 eukaryotic plasmid resulted in the increased expression of CRMP2 and BCL2(P<0.01) and the decreased p53, Caspase-3 and Caspase-8 expression. In TUNEL test, overexpression of CRMP2 obviously decreased the number of TUNEL positive cells(P<0.01).The expression of BDNF was upregulated after cerebral ischemic injury(P<0.01), while overexpression of CRMP2 increased BDNF more significantly(P<0.01).TTC staining showed cerebral infarction volumn of MCAO+CRMP2/GFP group was obviously decreased(P<0.01), and neurologic deficits were significantly improved(P<0.01).ConclusionThe overexpression of CRMP2 reduces nerve cell apoptosis possibly by regulating the mitochondrial apoptosis pathway after cerebral ischemia/reperfusion injury to protect nervous system.

收稿日期：2015-11-09，修回日期：2016-02-04

基金项目：国家自然科学青年基金资助项目(No 81200900)

作者简介：幸享凤(1989-)，女，硕士生，研究方向：脑血管病，E-mail：xingxiangfeng5@163.com； 秦新月(1963-)，女，博士后，教授，博士生导师，研究方向：脑血管病，通讯作者，E-mail: qinxy20011@sina.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.021

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)04-0548-06

中国图书分类号：R-332；R322.81；R329.25；R743.310.22

网络出版时间：2016-3-18 11:22网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.042.html