PTEN抑制剂对高糖诱导的内皮细胞衰老的影响

刘小莺吴　莉,陈　洲,刘礼斌

(福建医科大学 1.附属协和医院内分泌科福建省内分泌研究所、2. 老年健康研究院、3.药学院, 福建 福州　350001)



PTEN抑制剂对高糖诱导的内皮细胞衰老的影响

刘小莺1,2吴莉1,2,陈洲3,刘礼斌1,2

(福建医科大学 1.附属协和医院内分泌科福建省内分泌研究所、2. 老年健康研究院、3.药学院, 福建 福州350001)

摘要：目的PTEN抑制剂对高糖诱导内皮细胞衰老的影响。方法原代内皮细胞的培养和鉴定，CCK8检测细胞生存率，实验分为正常组(C)、高糖组(HG)，PIC处理组(PIC)。C组糖浓度为5.6 mmol·L-1(C组)，HG浓度为30 mmol·L-1(HG)，PIC组过氧钒(PIC)浓度为10、100 nmol·L-1，预培养半小时后加高糖。流式细胞测定细胞凋亡，β-半乳糖苷酶染色试剂盒(SA-β-Gal)染色测定阳性细胞数，实时定量PCR测定p16、PTEN基因表达，Western 印迹检测总PTEN p16蛋白表达水平。结果高糖降低内皮细胞生存率，高糖诱导内皮细胞PTEN基因及蛋白表达增加，增加β-半乳糖苷酶染色性阳性细胞数， p16、PTEN基因及蛋白表达增加。PIC增加高糖诱导的内皮细胞生存率，降低高糖诱导的内皮细胞p16、PTEN基因及蛋白的表达。高糖可以诱导内皮细胞凋亡，PIC降低高糖诱导的内皮细胞凋亡率。结论适当浓度PTEN抑制剂降低高糖诱导的内皮细胞衰老。高糖作用时间6 d可以诱导内皮细胞凋亡，PIC降低高糖诱导的内皮细胞凋亡率。

关健词：内皮细胞；PTEN；p16；细胞衰老；PI3K-AKT；高糖

糖尿病是心血管疾病的致病因素之一[1]。细胞不可逆的生长停滞的状态为衰老，糖尿病主要特征是高血糖，高糖可以诱导内皮细胞衰老[2]。动脉粥样硬化斑块处内皮细胞与非斑块处的内皮细胞相比，呈现出衰老细胞的特征，血管内皮细胞在衰老过程中，分泌的各种生物活性因子也在发生变化，如内皮依赖性血管舒张因子合成下降、炎性因子合成增加、黏附因子表达增多等[3]。细胞的老化加快动脉粥样硬化的进程[4]。

PTEN(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten)是具有脂质和蛋白双特异性磷酸酶活性的抑癌基因，去磷酸化PIP3，生成PIP2，负调节PI3K-AKT信号通路[5]。高糖抑制PI3K-AKT信号通路诱导内皮细胞凋亡是PTEN依赖性[6]。过氧钒(PIC)是蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制剂，低剂量就可以和PTEN酶结合，抑制其活性[7]。PI3K-AKT信号通路与细胞周期的调控有关，抑制PI3K-AKT使细胞处于G1期，诱导纤维细胞衰老[8]。因此，研究PTEN抑制剂对高糖诱导内皮细胞衰老相关细胞衰老的影响，为糖尿病血管并发症提供治疗的新思路。

1材料与方法

1.1材料内皮细胞专用培养基购自Sciencecell ；0.025 g·L-1胰酶，胶原酶Ι购自GIBCO；CCK8，β-半乳糖苷酶(β-gal)试剂盒购自碧云天；Annexin-V-FLUOS 染色试剂盒购自Roche公司；RNAprep Pure总RNA提取试剂盒试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；逆转录试剂盒购自Promega 公司，SYBR Premix Ex Taq 定量试剂盒购自日本TaKaRa公司；BCA蛋白定量试剂盒，HRP化学发光检测试剂盒购自武汉博士德公司；PTEN、 p16 抗体购自CST公司；过氧钒(PIC)购自Merck公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养取当天剖腹产新鲜脐带10～15 cm，0.01 g·L-1胶原酶Ι消化内皮细胞，37℃消化15 min。收集所有消化液，1000 r·min-1离心 15 min，弃上清，加入 4 mL培养液悬浮细胞，接种到塑料培养瓶中。细胞生长融合达80%～90%，胰酶消化细胞，取2～6代细胞做实验。

1.2.2原代内皮细胞签定FⅧ因子免疫组织化学染色鉴定内皮细胞。

1.2.3实验分组实验分为正常组、实验组、PIC处理组，正常组糖浓度为5.6 mmol·L-1(C组)，实验组糖浓度为30 mmol·L-1(HG)，PIC处理组的PIC浓度分别为1、10、100、1000 nmol·L-1(PIC)，PIC预培养0.5 h后加入高糖，各组作用时间为2、4、6 d，实验重复5次。选取合适的高糖处理时间和PIC处理浓度。

1.2.4CCK8检测细胞生存率96孔板每孔加入100 μL 105个细胞，按照实验需要进行培养，实验结果后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1 h，450 nm测定吸光度。

1.2.5β-半乳糖苷酶染色试剂盒(SA-β-Gal)测定细胞衰老衰老细胞在pH 6.0时有高β-半乳糖苷酶活性，以X-Gal为底物催化下会生成深蓝色产物。显微镜下可以看到蓝色的表达β-半乳糖苷酶的阳性细胞。6孔板培养的细胞，按实验分组处理细胞后，室温固定15 min，每孔加入1 mL染色工作液，37℃孵育6 h，显微镜下观察。计数阳性细胞数。

1.2.6FITC- PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率参照Annexin-V-FLUOS 染色试剂盒说明书操作：细胞分组干预后，用胰酶(0.25%，不含EDTA)消化处理细胞，1000 r·min-1离心5 min,收集细胞沉淀，PBS清洗2遍后，加入500 μL FITC/PI试剂盒缓冲液重悬细胞，取300 μL悬液于流式管中，分别加入FITC 3 μL、PI 3 μL，避光15 min后上机检测。

1.2.7实时荧光定量PCR测定RNAprep Pure总RNA提取试剂盒，电泳结果显示出清晰的28 S和18 S两条带，且28 S>18 S，Rromega逆转录试剂盒获得cDNA产物(按Rromega公司反转录试剂盒说明书进行)，SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应在LightCycle荧光PCR仪上测定,引物分别是：目标基因p16 5′-CCCCACTACCGTAAATGTCCA-3′;5′-TG CTCACTCCAGAAAACTCCAA-3′目标基因PTEN5′-TCAGGCGAGGGAGATGAGA-3′,5′-GACGAAGAGGA GGCGAGAAA-3′ PTEN 目标基因P21 5′-TCAAAT CGTCCAGCGACCTTC-3′;5′-CATGCCCTGTCCATAG CCTCTAC-3′内参基因(GAPDH)的扩增效率一致，不同试验组内参基因GAPDH相差1～2个循环，利用2-△△CT方法进行相对定量。

1.2.8Western blot检测总PTENp16蛋白水平：收集细胞，裂解液裂解，4℃，12 000 r·min-1离心10 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，上样缓冲液稀释各样品蛋白，95℃变性5 min后上样。先后经电泳、转膜、封闭过夜后，分别加入PTEN、p16一抗4℃振荡过夜，TBST洗5 min×3次，加入HRP标记的二抗常温孵育1 h，ECL法显影，应用凝胶成像分析仪测定蛋白条带灰度后，计算各蛋白条带和内参照β-actin 的比值。

2结果

2.1内皮细胞的培养和鉴定原代内皮细胞培养3 h后开始贴壁，24 h完全贴壁，早期贴壁细胞呈短梭形，细胞多成团生长，少数细胞分散生长；2～3 d后细胞单层铺满呈铺路石样生长(Fig 1)。内皮细胞FⅧ抗原相关染色鉴定，FⅧ是由因子FⅧ促凝成分(FⅧ∶C)和内皮细胞合成的vWF(von Willebrand factor)组成的一种复合物，FⅧ抗原阳性细胞表现为胞质中可见染成棕褐色的颗粒，取3～5代的细胞做实验。Fig 1A原代培养HUVECs细胞形态(×200);Fig 1B细胞免疫化学染色法鉴定HUVECs(×400)，胞质中出现棕褐色颗粒细胞为FⅧ抗原阳性表达细胞。

A：Morphology of HUVEC(×100)；B：Identification of HUVEC by FⅧ immunochemical staining

2.2CCK-8测定细胞的生存率Fig 2A： HG组不同时间点高糖对内皮细胞生存率的影响，以C为对照组，30 mmol·L-1高糖降低内皮细胞生存率,并随时间延长降低，作用2、4、6 d生存率分别为86.5%±3.5%、73.5%±5.1%、65.4%±4.6%(P<0.01，n=5)；Fig 2B: PIC 对内皮细胞生存率的影响，与C组相比，1000 nmol·L-1PIC降低内皮细胞生存率，生存率为76.2%±3.7% (P<0.01，n=5)，其它浓度PIC对内皮细胞生存率没的影响；Fig 2C: 以C对照组，不同浓度 PIC 预培养0.5 h后，30 mmol·L-1高糖作用4 d对细胞生存率的影响，与高糖作用组相比，10、100 nmol·L-1PIC可以增加高糖作用内皮细胞的生存率(P<0.01，n=5)。

2.3PTEN抑制剂对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响根据CCK8结果实验分为以C组、高糖处理组(HG)、PIC 10 nmol·L-1+高糖处理组、PIC 100 nmol·L-1+高糖处理组，作用时间为6 d。流式结果显示C、HG、PIC 10 nmol·L-1+高糖处理组、PIC 100 nmol·L-1+高糖处理组凋亡率分别为(10.2±1.06)%、(28.64±1.83)%、(16.40±1.86)%、(15.40±1.16)%，高糖作用内皮细胞6 d，细胞的凋亡率增加，PIC 10 nmol·L-1+高糖处理组、PIC 100 nmol·L-1+高糖处理组降低高糖诱导的细胞凋亡。与C组相比，HG组P<0.01；PIC组与HG相比，P<0.01；PIC 10 nmol·L-1+高糖处理组、PIC 100 nmol·L-1+高糖处理组相比差异没有显著性，n=3。如Fig 3所示。

A:Different time of high glucose on endothelial cell survival rate; B:Influence of different concentration of PIC on endothelial cell survival rate;C: Influence of different concentration of PIC on high glucose induced endothelial cell survival rate.**P<0.05vsHG

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG

2.4PTEN抑制剂对高糖诱导的内皮细胞衰老的影响实验分为C组、高糖处理组(HG)、PIC 10 nmol·L-1+高糖组、PIC 100 nmol·L-1+高糖组，作用时间为4 d。 A图显示SA-β-Gal染色：衰老细胞表达绿色阳性细胞，HG组较C组SA-β-Gal的阳性细胞数增加，PIC 10 nmol·L-1+高糖组、PIC 100 nmol·L-1+高糖组较HG组SA-β-Gal的阳性细胞数降低。B图显示定量PCR结果： HG组较C组p16 mRNA表达增加(3.3±0.6)倍，PIC 10 nmol·L-1+高糖组、PIC 100 nmol·L-1+高糖组较HG组p16mRNA分别降为(2.3±0.6)、(2.1±0.4)倍。C图显示Western-blot蛋白灰度扫描结果：HG组较C组p16蛋白表达增加(2.7±0.4)倍，PIC 10 nmol·L-1+高糖组、PIC 100 nmol·L-1+高糖组较HG组p16蛋白表达分别降为(1.7±0.2)、(1.6±0.6)。如Fig 4所示。

A:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell senescence by SA-β-gal l staining;B:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell p16rnRNA expression;C:The influence of PTEN inhibitors on high glucose induced endothelial cell p16 protein expression.*P<0.05vsHG

2.5高糖对内皮细胞PTENmRNA及蛋白的影响对照组(C)、高糖组(HG)72 h，定量PCR结果显示HG组较C组PTENmRNA增加(2.7±0.6)倍；Western blot结果显示蛋白灰度PTEN/Actin比较，HG组较C组PTEN蛋白表达增加1.81±0.23。如Fig 5所示。

*P<0.05vscontrol

3讨论

细胞周期可分为G1、S、G2，M 4个时期，细胞周期停滞是细胞衰老的一个关键特征，研究发现衰老细胞主要含有G1期的DNA，衰老细胞停滞于G1期，不能顺利进人S期，细胞不可逆的生长停滞。p16基因是一种抑癌基因，在细胞周期的G1期调控中起重要作用，p16蛋白抑制细胞周期。G1-S期的转化受Rb-p16-cdk4/6调控[9]。研究发现, 细胞衰老时, p16 表达明显增高; 当细胞中导入p16 基因可出现衰老表型，因此p16 是细胞寿限的关键调控基因[10]。细胞衰老时乳糖苷酶活性增加，SA-β-Gal染色呈绿色阳性。实验结果发现与正常组相比，高糖(30 mmol·L-1)作用内皮细胞4 d，表达SA-β-Gal绿色阳性细胞增加，p16mRNA 及蛋白表达增加，因此高糖作用内皮细胞4 d可以诱导内皮细胞衰老。

细胞衰老影响细胞膜完整性，细胞内生成的自由基、不完全氧化产生的自由基攻击细胞膜上的胆固醇和不饱和脂肪酸。产生的有毒分子导致细胞凋亡和细胞死亡。实验结果显示，高糖(30 mmol·L-1)作用内皮细胞4 d内皮细胞老化，作用6 d后细胞凋亡增加，存活率明显下降。

研究表明高糖通过上调PTEN诱导内皮细胞凋亡[11]，实验结果高糖作用内皮细胞4 d PTEN mRNA 及蛋白表达增加2倍以上，PTEN具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性，负调节PI3K-AKT信号通路，参与调控细胞多种功能如细胞周期进展，细胞迁移、扩散和生长[12]。PIC是PTEN的抑制剂，蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制剂，较小的剂量就可以抑制PTEN，调节PI3K-AKT信号通路。PTEN抑制对损伤的神经元具有保护作用[13]，PTEN抑制剂能缓解内毒素诱导的急性肺损伤[14]。CCK8结果显示，单独0.1～100 nmol·L-1PIC作用低糖培养的内皮细胞，0.1～100 nmol·L-1PIC内皮细胞的生存率略增加，1000 nmol·L-1PIC对细胞生长具有抑制作用；高糖(30 mmol·L-1)培养内皮细胞4 d可以抑制细胞生存率，0.1 nmol·L-1PIC预培养不能改善高糖作用的内皮细胞生存率，10、100 nmol·L-1预培养增加高糖作用的内皮细胞生存率，100 nmol·L-1增加细胞生存率10 nmol·L-1没有明显区别，因此选择10、100 nmol·L-1PIC为实验浓度，此浓度范围能有效抑制PTEN并且对细胞没有毒性作用。流式结果显示，10、100 nmol·L-1PIC预处理可以降低高糖诱导的细胞凋亡。PTEN调节胰岛β细胞p16的表达，PTEN敲除可以恢复老化和受损的胰岛β细胞再生[15]。结果显示内皮细胞p16受PTEN调节，10、100 nmol·L-1PIC使p16mRNA 及蛋白表达降低，SA-β-Gal绿色阳性细胞减少。PTEN抑制剂可以降低高糖诱导的内皮细胞衰老。

PTEN和p16是体内的抑癌基因，体内主要是起抑制肿瘤的作用。实验结果表明，高糖作用内皮细胞，抑癌基因表达增加诱导细胞衰老，同时抑制肿瘤的发生。说明体内细胞在不良环境下，诱导细胞衰老，防止肿瘤的产生，这也是体内的一种保护机制。

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PTEN inhibitors attenuates high glucose induced endothelial cell senescence

LIU Xiao-ying1,2, WU Li1,2, CHEN Zhou3, LIU Li-bin1,2

(1.FujianMedicalUniversityUnionHospitalEndocrinologyFujianInstituteofEndocrinology,Fuzhou350001,China; 2.ElderlyHealthResearchInstitute,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China; 3.FujianMedicalUniversityCollegeofPharmacy,Fuzhou350001,China)

Key words:endothelial cell; PTEN; p16; cell senescence; PI3K-Akt; high glucose

Abstract:AimTo study influence of PTEN inhibitors(PIC) on high glucose induced endothelial cell senescence Methods(1)HUVECs were cultured in ECM medium. Cell viability was determined by CCK-8. Cells were randomly divided into control group(C), high glucose group(HG), high glucose+10 nmol·L-1PIC group(HG+10 nmol·L-1PIC), high glucose+100 nmol·L-1PIC group(HG+100 nmol·L-1PIC). Cell apoptosis was examined by flow cytometry. Senescence Detection Kit was performed by SA-β-gal Cytochemical staining. The expression levels of genes and protein (p16 and Pten ) were detected by real-time PCR and Western blot. ResultsThe proliferation rate was markedly decreased in HG group compared with C group, and this phenomenon was reversed by PTEN inhibitors . Cell apoptosis was significantly increased in HG group compared with C group, and again these changes were blocked by PIC.The expression levels of genes (PTEN) were significantly higher in HG group compared with C group. The frequency of senescent (SA-β-Gal-positive) cells and the expression level of senescence genes (p16) were significantly higher in HG group compared with C group, and these changes were blocked by PIC. ConclusionThese results show that PTEN inhibitors(PIC) delays cellular senescence that is promoted under high glucose condition.

收稿日期：2015-12-15，修回日期：2016-02-13

基金项目：国家临床重点专科老年医学项目(No 2010306); 福建省自然科学基金资助项目(No 2014J01335)

作者简介：刘小莺(1972-)，女，硕士，副主任技师，研究方向：糖尿病血管并发症，E-mail:lxy666-123@163.com; 刘礼斌(1967-)，男，博士，主任医师，教授，博士生导师，研究方向：糖尿病血管并发症，通讯作者，Tel:0596-83357896-8452，E-mail:libin.liu@hotmail.com.

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.04.015

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)04-0514-06

中国图书分类号：R329.25；R339.38；R394.2；R977.3；R977.6

网络出版时间：2016-3-18 11:22网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.030.html