黄芪多糖抑制NF-κB/MAPK信号通路和改善哮喘大鼠气道炎症的作用

王金磊，李承德，孙宏伟，毛淑梅， 张晓俊， 曲梅花

(潍坊医学院 1.药理学教研室、山东省重点应用药理学实验室， 2. 应用心理学教研室，山东 潍坊　261053)



黄芪多糖抑制NF-κB/MAPK信号通路和改善哮喘大鼠气道炎症的作用

王金磊1，李承德1，孙宏伟2，毛淑梅1， 张晓俊1， 曲梅花1

(潍坊医学院 1.药理学教研室、山东省重点应用药理学实验室， 2. 应用心理学教研室，山东 潍坊261053)

摘要:目的观察黄芪多糖(astragalus polysaccharide, APS)对哮喘大鼠气道炎症及NF-κB/MAPK信号通路的影响。方法采用卵蛋白(ovalbumin，OVA)致敏法制备哮喘模型并予以药物治疗。观察支气管灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎症细胞分类计数、肺组织病理变化、肺泡Ⅰ型上皮超微结构变化；测定肺组织NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65 (p-NF-κB p65)、磷酸化IκBα(p-IκBα)、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、JNK、磷酸化JNK(p-JNK)、p38 MAPK、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及 IL-13含量的变化。结果与正常组比较，OVA致敏明显升高哮喘组炎症细胞数量、增强NF-κB/MAPK信号通路活性。APS可改善哮喘大鼠气道炎症、肺Ⅰ型上皮损伤，并明显抑制NF-κB/MAPK信号通路活性。结论APS改善哮喘大鼠气道炎症、细胞损伤的机制可能与抑制NF-κB/MAPK信号通路有关。

关键词：黄芪多糖；哮喘；炎症；NF-κB/MAPK信号通路；疗效；机制

支气管哮喘是一种炎症性呼吸系统疾病，严重影响人类健康[1-2]。NF-κB/MAPK信号通路可介导炎症反应，在哮喘发生、发展中发挥重要作用[3-4]。目前治疗哮喘以激素等为主，久用不良反应较大。中医中药在哮喘防治方面积累了大量经验，黄芪作为一种具备免疫调节功能的药物，在哮喘的防治上发挥着重要作用。黄芪提取物黄芪多糖(astragalus polysaccharide, APS)在多种疾病的动物模型中显示了良好的抗炎作用[5]，课题组前期研究发现，APS可抑制支气管哮喘大鼠气道炎症并调节Th17/Treg 细胞因子表达[6]。但是，APS治疗哮喘的机制是否与调节NF-κB/MAPK信号通路有关未见报道，本研究拟就上述问题进行探索。

1材料与方法

1.1材料

1.1.2药品试剂与仪器卵蛋白(ovalbumin，OVA)购于美国Sigma公司，氢氧化铝购于淄博化学试剂公司，NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及 IL-13酶联免疫试剂盒购于美国Cell Signaling公司、R&D公司、武汉华美公司及上海邦奕公司。雾化泵(德国PARI公司)，H-7500 型透射电子显微镜(日立公司) 。

1.2方法

1.2.1模型制备哮喘组、APS组大鼠于分组后第1天(d 1)，腹腔注射致敏液混悬剂2 mL(含有OVA 100mg，氢氧化铝200 mg)，于d 8第2次注射致敏液。从d 15起，大鼠接受连续28 d的1% OVA雾化吸入(20 min，40 mL)，每日1次。正常组仅腹腔注射及雾化吸入生理盐水。

1.2.2药物治疗从d 1 开始，大鼠接受连续6周的药物干预。APS组予以腹腔注射APS 400 mg·kg-1·d-1(多项动物实验显示，该剂量在大鼠体内可发挥多种药理学效应[7]，课题组前期研究也发现，该剂量在大鼠体内具有免疫调节、抗炎等作用[6])，正常组及哮喘组腹腔注射等体积的生理盐水。

1.2.3HE染色治疗结束处死大鼠，取右肺组织，10%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片(4 μm)，进行HE染色，光镜分析病理变化。

1.2.4电镜处死大鼠后，迅速取1 mm3大小的肺组织置于2.5%戊二醛前固定，继以1%锇酸后固定，脱水环氧树脂包埋，超薄切片(1 μm)铀铅染色，电镜观察肺泡Ⅰ型上皮超微结构。

1.2.5肺泡灌洗液炎症细胞计数左侧肺脏以生理盐水(37 ℃)灌洗，收集灌洗液，2 500 r · min-1离心10 min。回收细胞进行瑞氏染色，光镜下分类计数炎症细胞数量。

1.2.6ELISA检测取右肺新鲜组织，加入4 ℃生理盐水匀浆(1 g 组织加入2 mL生理盐水)，2 500 r · min-1离心10 min，取上清液，ELISA法检测其中NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκBα、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及 IL-13含量。ELISA操作严格按说明书进行。

草酸铵法避免了高酸环境给操作人员带来的伤害，但草酸铵本身有毒，高温条件下会释放出氨气。所以，该法的生产安全性、环境影响以及工业可行性还有待研究。其基本原理是草酸铵中的草酸根离子能与果胶酸中的钙反应生成可溶性果胶铵盐[21]。

2结果

2.1APS对BALF中炎症细胞数量的影响与正常组比较，哮喘组BALF中含有更多数量的巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞及中性粒细胞(P<0.05)；与哮喘组比较，APS组BALF中上述炎症细胞数量均明显降低(P<0.05)；但APS组上述炎症细胞数量仍明显高于正常组(P<0.05)。见Tab1。

#P<0.05vsnormal group;△P<0.05vsasthma

2.2APS对大鼠肺组织形态学病变的影响HE染色显示，正常组未见异常，肺泡轮廓完整清晰，未见明显的炎症细胞浸润。哮喘组肺泡轮廓欠清晰，肺泡壁明显水肿、增厚，部分肺泡扩张，大量炎症细胞浸润。与哮喘组比较，APS组肺泡轮廓较清晰，肺泡壁水肿明显减轻、炎症细胞浸润明显减轻；但与正常组比较，APS组仍存在较明显的肺泡壁水肿、炎症细胞浸润等表现。见Fig 1。

2.3APS对大鼠肺泡Ⅰ型上皮细胞超微结构的影响电镜下可见，哮喘组大鼠肺泡Ⅰ型上皮细胞线粒体肿胀、嵴模糊，高尔基复合体不发达，染色质聚集。与哮喘组比较，APS组大鼠肺泡Ⅰ型上皮细胞上述超微结构变化明显减轻。见Fig 2。

2.4APS对大鼠肺NF-κB信号通路活性的影响与正常组比较，哮喘组肺部NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα含量明显升高(P<0.05)。与哮喘组比较，APS组肺部NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα含量明显降低(P<0.05)；但APS组上述指标含量仍高于正常组(P<0.05)。见Tab2。

#P<0.05vsnormal group;△P<0.05vsasthma

2.5APS对大鼠肺MAPK信号通路活性的影响与正常组大鼠比较，哮喘组肺部ERK1/2、JNK、p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK含量明显升高(P<0.05)。与哮喘组比较，APS组肺部上述指标含量明显降低(P<0.05)；但APS组上述指标含量仍高于正常组(P<0.05)。见Tab3。

2.6APS对大鼠肺细胞因子的影响与正常组比较，哮喘组肺组织炎性细胞因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-13含量明显增高(P<0.05)。与哮喘组比较，APS组上述细胞因子含量明显降低(P<0.05)；但APS组含量仍高于正常组(P<0.05)。见Tab4。

3讨论

本研究首先观察了APS对哮喘大鼠肺部炎症的影响，结果表明，APS明显降低了哮喘大鼠BALF炎症细胞数量、抑制了肺组织炎症反应。肺泡Ⅰ型上皮对于维持正常的肺功能具有重要的作用，哮喘时该上皮易受累，导致呼吸功能下降。本研究结果显示，APS明显改善了OVA诱导的肺泡Ⅰ型上皮超微结构损伤。既往研究也就APS对哮喘的疗效进行了探讨，宋泽庆等发现APS对哮喘小鼠特异性免疫治疗具有增强作用。俞建芬等报道APS可改善哮喘小鼠气道高反应性及气道重塑。课题组前期研究显示APS可调节哮喘大鼠Th17/Treg细胞因子平衡[6]。这些研究均证明APS对哮喘具有治疗作用。

近年研究显示，NF-κB/MAPK信号通路过度激活在哮喘的发病中发挥作用[3-4]。通常NF-κB被IκB抑制，以非活性形式存在于细胞质。当IκB发生磷酸化，失去了对NF-κB的抑制作用，活化的磷酸化-NF-κB可转位至细胞核，促进基因转录，继而增加炎性细胞因子表达，促进哮喘发展。本研究显示，哮喘组NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα表达升高，表明NF-κB通路过度激活。其他研究也显示哮喘动物NF-κB通路活性较正常动物增加[9-10]，与本研究结果一致。本研究中，APS组大鼠NF-κB p65、p-NF-κB p65及p-IκBα表达较哮喘组明显降低，表明APS可明显抑制NF-κB通路活性。MAPK信号通路在炎症反应中发挥重要作用，MAPK信号通路主要包括分别由ERK1/2、JNK、p38 MAPK介导的三条级联反应，该通路的激活可促进炎症细胞因子的生成而加剧炎症反应。有研究表明哮喘动物MAPK信号通路较正常动物活性增强[11]。本研究显示，哮喘组大鼠肺部ERK1/2、JNK、p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK含量较正常组明显升高，这与既往报道相一致[11-13]。本研究中，APS明显降低了哮喘大鼠肺部ERK1/2、JNK、p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK含量，表明APS可抑制OVA诱导的MAPK信号通路过度激活。

#P<0.05vsnormal group；△P<0.05vsasthma group

#P<0.05vsnormal group；△P<0.05vsasthma group

本研究尚检测了大鼠肺部NF-κB/MAPK信号通路下游炎性细胞因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-13的表达。结果表明哮喘组大鼠上述细胞因子水平明显升高，这同既往其他研究报道一致[14-16]。在本研究中，与APS抑制NF-κB/MAPK信号通路的过度激活相一致，APS也明显抑制了哮喘大鼠炎性细胞因子IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6及IL-13表达。

综上所述，OVA引起了大鼠NF-κB/MAPK信号通路过度激活以及炎性细胞因子过度分泌。与文献报道一致，上述通路的激活以及炎性细胞因子的过度分泌，可引起炎症级联反应、加剧肺部炎症，促进肺上皮损伤，增加气道反应性，并引起气道重构[3-4,17-18]。针对此，大量研究以药物对哮喘进行干预，旨在降低NF-κB/MAPK信号通路的过度激活及炎症因子的过度分泌，结果表明能改善上述靶点的药物，可明显减轻哮喘病变[3-4,19]。本研究中，APS亦明显降低了OVA引起的NF-κB/MAPK信号通路过度激活及炎症因子过度分泌，同时减轻了肺部炎症以及肺泡Ⅰ型上皮细胞超微结构损伤，理论上推测大鼠哮喘表现的好转可能与APS抑制NF-κB/MAPK信号通路及炎症因子水平有关。在既往报道中，虽然有众多的中药提取物表现出了一定的抗哮喘作用，但与阳性对照药物糖皮质激素比较，多数提取物均未达到或优于糖皮机制激素的疗效[20-21]。与此类似，本研究中APS虽然明显抑制了NF-κB/MAPK信号通路及炎症因子分泌，但其水平仍明显高于正常对照组，与此一致，APS组虽然肺部炎症得到缓解，但与正常组比较，仍然存在显著的炎症，故APS对哮喘时的肺部炎症仅有部分缓解作用。

总之，APS可明显缓解哮喘大鼠肺部炎症反应，同时减低了NF-κB/MAPK信号通路活性。故推测，APS改善哮喘的作用可能与抑制NF-κB/MAPK信号通路有关。

(致谢：本研究在山东省潍坊医学院应用药理学实验室完成。)

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Astragalus polysaccharide regulates NF-κB/MAPK signaling pathway and attenuates airway inflammation in OVA-induced asthmatic rats

WANG Jin-lei1, LI Cheng-de1, SUN Hong-wei2, MAO Shu-mei1， ZHANG Xiao-jun1, QU Mei-hua1

(1.DeptofPharmacology; 2.DeptofPsychology,WeifangMedicalCollege,WeifangShandong261053,China)

Key words：astragalus polysaccharide; asthma; inflammation；NF-κB/MAPK signaling pathway; effect; mechanism

Abstract：AimTo detect the possible ameliorative effects of APS on the airway inflammation and whether the effects are associated with inhibiting the NF-κB/MAPK signaling pathway in ovalbumin(OVA)-induced asthmatic rats. MethodsAsthma was induced by OVA sensitization and challenge. The asthmatic rats in the APS group were treated with APS. Pulmonary inflammation was assessed with hematoxylin and eosin staining and inflammatory cell counting in BALF. Ultrastructural changes of type I pneumocyte were observed by electron microscopy. Levels of NF-κB p65, p-NF-κB p65, p-IκBα, ERK1/2, p-ERK1/2, JNK, p-JNK, p38 MAPK, p-p38 MAPK, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6 and IL-13 were measured using ELISA to assess the activity of NF-κB/ MAPK signaling pathway. ResultsCompared to the normal group, OVA induced significantly pulmonary inflammation and ultrastructural changes of type I pneumocyte in the asthma group. Besides, OVA increased the activity of the NF-κB/MAPK signaling pathway and promoted the production of inflammatory cytokines IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6 and IL-13 in the asthma group. If compared to the asthma group, APS markedly attenuated the pulmonary inflammation and type I pneumocyte damage, as well as inhibited the activity of the NF-κB/MAPK signaling pathway and decreased the production of inflammatory cytokines in the APS group. ConclusionThe ameliorative effects of APS on airway inflammation might be associated with the inhibition of the activity of the NF-κB/MAPK signaling pathway.

收稿日期：2015-12-03，修回日期：2016-02-22

基金项目：山东省自然科学基金资助项目(No ZR2009CL045, ZR2011HL066, ZR2013CM033, ZR2015CL029)；山东省教育厅科技计划项目(No J15LL54，J14LL55)；山东省中医药管理局项目(No 2013-242, 2015-237)

作者简介：王金磊 (1987-)，男，硕士生，研究方向：呼吸系统疾病，Tel: 0536-2769729，E-mail: 623525679@qq.com； 毛淑梅(1976-)，女，副教授，硕士生导师，研究方向：呼吸系统药理、内分泌药理学，通讯作者，Tel: 0536-8985866，E-mail: maoshumei@126.com

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.03.010

文献标志码：A

文章编号：1001-1978(2016)04-0489-05

中国图书分类号：R-332；R284.1；R329.25；R364.5；R562.250.531

网络出版时间：2016-3-18 11:22网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160318.1122.020.html