园艺植物扶芳藤叶总黄酮的体外抗氧化活性

邵菁菁+王恒+胡晓倩

摘    要：通过总黄酮的提取及其对自由基的清除能力研究，可为园艺植物扶芳藤提供新的深层次开发和利用方向。将扶芳藤叶片洗净烘干至恒质量，粉碎后分别采用石油醚、75%乙醇在索式提取器里回流浸提，然后减压浓缩提取液，得到扶芳藤叶总黄酮提取物，以芦丁和Vc为阳性对照，进行体外抗氧化试验研究。结果显示，扶芳藤叶总黄酮提取物具有较强的体外抗氧化活性，清除超氧阴离子自由基能力远远优于芦丁和Vc，清除羟基自由基和DPPH·自由基的能力与芦丁和Vc相当，且在试验浓度范围内，清除能力随扶芳藤叶中总黄酮提取物浓度的增加而呈上升趋势。研究认为扶芳藤叶可加强作为天然抗氧化剂来源的应用，同时，该研究可为园艺植物扶芳藤具有的药用保健作用提供机理阐释的参考。

关键词：扶芳藤;总黄酮;自由基;抗氧化

中图分类号：Q945             文献标识码：A         DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.01.009

Antioxidant Activities of the Total Flavonoids from the Horticulture Plant of Euonymus fortunei Hand. Leaves

SHAO Jingjing，WANG Heng，HU Xiaoqian

（College of Life and Environment Sciences， Huangshan University， Huangshan， Anhui 245041， China）

Abstract： In order to provide a new way for the development and utilization of the horticulture plant of Euonymus fortunei Hand.， the extraction of total flavonoids and its scavenging ability on free radicals were studied. Euonymus fortunei Hand. leaves were dried and pulverized to powder， then were extracted in Soxhlet extractor with petroleum ether and 75% ethanol. The extract was concentrated by vacuum and total flavonoids from Euonymus fortunei Hand. leaves were gotten. The antioxidant properties in vitro. of total flavonoids from the leaves of Euonymus fortunei Hand. were studied with rutin and Vc as positive control. The result showed that the total flavonoids from the leaves of Euonymus fortunei Hand. had a good anti-oxidant properties， its scavenging ability of superoxide anion free radical of was much better than that of rutin and Vc， and its scavenging ability of hydroxyl and DPPH· radicals was almost equal to that of rutin and Vc. In the range of experimental concentration， the scavenging capacity raised with the increase of the concentration of the total flavonoids. It is concluded that the leaves of Euonymus fortunei would be enhanced development as natural antioxidants to improve economic value of deep processing. And then， the experiment could provide the basis to clarify the mechanism of medicinal and healthy function of Euonymus fortunei Hand..

Key words： Euonymus fortunei; total flavonoids; free radical; antioxidantion

扶芳藤 （Euonymus fortunei（Turcz.）Hand.-Mzt.），属卫矛科（Celastraceae）卫矛属（Euonymus L.），其叶夏季黄绿相间、冬季颜色鲜红，且能抗SO2、SO3等有害气体，是优良的彩化绿化园艺植物;其根、茎、叶、果、种子等均可入药，具降压、镇痛抗风湿、改善微循环、抗衰老及提高机体非特异性免疫等药用和保健功能[1]。摘其茎叶制成茶饮，不仅可以生津止渴，还具保健和药用价值[2]。动物药理实验研究表明，扶芳藤的粗提物及其复合制剂具有明显的降压、防治风湿、抗应激、抗心肌缺氧、抗衰老和改善微循环等作用[3-6]。因此，扶芳藤是一种既具观赏绿化园艺价值，又具药用、茶饮和保健价值的资源植物。endprint

黄酮是黄酮类天然产物的总称，具抗肿瘤、提升机体免疫、防动脉硬化、疏通微循环、抗衰老、抗菌抗病毒等多种生理活性及功效[7]。

近年来，卫矛科卫矛属植物对人体的生理活性已引起国内外学者重视，对卫矛属植物的化学成分与药理研究多有报道[8-10]，对扶芳藤的化学成分，如卫矛属植物中的典型代表成分卫矛醇，还有黄酮类、三萜类、甾醇等的含量和测试方法都有了一定的研究[11-14]，但对具园艺和药用双重作用的资源植物扶芳藤，其叶中总黄酮的体外抗氧化活性的研究还未见报道。

本试验以总氧化还原能力，对超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH·自由基的清除能力为评价指标，研究扶芳藤叶总黄酮提取物的体外抗氧化活性，旨在为园艺植物扶芳藤的药用保健作用机理提供科学阐释的参考，并为此资源植物的深入综合开发提供参考数据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与仪器

扶芳藤植株采自安徽清凉峰国家自然保护区，由黄山学院生命与环境科学学院张慧冲副教授鉴定。

试验试剂芦丁（芸香叶苷·三水烘干至恒质量，无水，纯度99.99%）、75%乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、邻二氮菲、PBS（磷酸缓冲盐溶液）、硫酸亚铁、DPPH·（二苯代苦味酰基自由基），均为国产分析纯。

SXT-02索氏提取器（上海洪纪仪器设备有限公司），RE-52D旋转蒸发仪（上海青浦沪西仪器厂），HH-S恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器有限公司），WFZ UV-2100紫外分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）等。

1.2 试验方法

1.2.1 扶芳藤叶中总黄酮化合物的提取工艺 新鲜扶芳藤叶洗净，60 ℃烘箱中烘干至恒质量后粉碎成粉末。称取2.5 g扶芳藤叶干粉，滤纸捆扎后放入索氏提取器，加入125 mL石油醚，90 ℃进行回流浸提脱脂约2 h，再加入75%乙醇125 mL回流浸提约5 h，旋转蒸发器45 ℃减压浓缩至浓稠果冻状，得扶芳藤浓缩液，加入少量蒸馏水，煮沸并过滤，得扶芳藤总黄酮化合物的提取液[15-16]。定容至250 mL，冷藏待用。

1.2.2 扶芳藤叶中总黄酮含量的测定  （1）标准曲线的制备[17-18]。称取10.0 mg芦丁（芸香叶苷·三水，烘干至恒质量，无水），加入75%乙醇定容至100 mL，配成0.1 mg·mL-1芦丁标准溶液保存备用。取6支25 mL容量瓶，分别取上述芦丁标准溶液1.0，3.0，5.0，7.0，9.0，11.0 mL，加入5%亚硝酸钠1.0 mL，摇匀并放置6 min。再加入10%硝酸铝1.0 mL摇匀并放置6 min。最后加入4%氢氧化钠10.0 mL，并用75%乙醇定容至25.0 mL充分摇匀，放置10 min。以试剂空白做对照，502 nm测定吸光值。每组平行测定4次，取平均值。

以吸光值A（X）为横坐标，以浓度C（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。得线性回归方程为：Y（C）=0.125 1X（A）+0.001 3，R2 =0.999 5，线性范围0.004～0.044 mg·mL-1，线性关系良好（图1）。

（2）扶芳藤叶中总黄酮化合物含量及提取率计算[17-19]。分别移取3.0，4.0，5.0 mL扶芳藤总黄酮提取液，按照“标准曲线制备”下的操作，测定不同浓度溶液的吸光值，由芦丁溶液标准曲线计算总黄酮浓度。由下列公式计算总黄酮含量和提取率。

总黄酮含量C（mg·mL-1）=Y×稀释倍数

总黄酮提取率=[Y×稀释倍数×V×100%]/1 000W

式中，Y为扶芳藤叶中的黄酮含量（mg·mL-1）;V为原浸提液体积（mL）;W为扶芳藤叶样品的质量（g）。

1.2.3 扶芳藤叶中总黄酮的总抗氧化还原能力的测定（普鲁士蓝法） 取扶芳藤叶总黄酮提取液，按照体积比稀释成5%，10%，20%，30%的总黄酮溶液。以芦丁溶液和VC溶液（芦丁溶液、VC溶液浓度与未稀释的扶芳藤总黄酮提取液的浓度相同）为对照。各取以上溶液1.0 mL，加入pH值6.6磷酸钠缓冲液2.5 mL，再加入1%铁氰化钾溶液2.5 mL。50 ℃水浴中加热20 min，加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，摇匀后移取2.5 mL，分别加蒸馏水2.5 mL和0.1%三氯化铁2.5 mL，静置10 min。700 nm测定各溶液的吸光值[20]。各溶液的吸光值越大，说明还原性越强，抗氧化性能越高[21]。

1.2.4 扶芳藤叶中总黄酮对超氧阴离子自由基清除能力的测定（邻苯三酚自氧化法）  pH值8.2的Tris-HCl缓冲液6.0 mL，分别加入未稀释的扶芳藤总黄酮提取液、按照体积比稀释成1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%的扶芳藤总黄酮提取液、对照芦丁溶液和VC溶液（芦丁溶液、VC溶液浓度与未稀释的扶芳藤总黄酮提取液的浓度相同）各0.5 mL，再加入37 ℃水浴加热的50 mmol·L-1邻苯三酚盐酸溶液0.5 mL，摇匀后静置4 min，最后加入1.0 mL浓HCl终止反应，322 nm测定各溶液的吸光值。以等体积pH值8.2的Tris-HCl缓冲液为空白对照，吸光度记为A。按照下列公式计算对超氧阴离子自由基的清除率[20]。

O2-·清除率=[A0-A]/A0×100%

式中 ，A0为Tris-Hcl缓冲液的吸光值;A为被测各样品溶液的吸光值。

1.2.5  扶芳藤叶中总黄酮对羟基自由基的清除能力测定（邻二氮菲-Fe氧化法） 取5 mmol·L-1邻二氮菲1.5 mL，加入现配制的pH值7.4的磷酸钠缓冲液4.0 mL，摇匀后加入7.5 mmol·L-1硫酸亚铁溶液1.0 mL，分别加入未稀释扶芳藤总黄酮提取液、按照体积比稀释成5%，10%，20%，30%的扶芳藤总黄酮提取液、对照芦丁溶液和Vc溶液（对照芦丁溶液、Vc溶液浓度与未稀释的扶芳藤总黄酮提取液的浓度相同）1.0 mL，然后加入1.5 mL蒸馏水，再加入0.1%双氧水1.0 mL，摇匀后置于37 ℃水浴中加热1 h，536 nm测定各溶液的吸光值。按照下列公式计算对羟基自由基的清除率[20]。endprint

·OH清除率=A（加）- A（损）/A（未损）-A（损）×100%

式中，A（加）为试验组中加入样品或抗氧化剂以及双氧水;A（损）为试验组中没有加入抗氧化剂，只加了双氧水;A（未损）为两者都不加。

1.2.6  扶芳藤中总黄酮对DPPH·自由基清除能力的测定（DPPH法） （1）DPPH·的配置：精确称取0.004 g DPPH·，用80%乙醇溶液定容至500 mL，摇匀，即得浓度8 mg·L-1的DPPH·溶液，存于棕色试剂瓶并置于冰箱中冷藏备用。

（2）DPPH·自由基清除能力的测定：分别加入未稀释扶芳藤总黄酮提取液、按照体积比稀释成1%，2%，3%，4%，5%，10%，20%，30%的扶芳藤总黄酮提取液、对照芦丁溶液和VC溶液（对照芦丁溶液、VC溶液的浓度与未稀释的扶芳藤总黄酮提取液的浓度相同）2.0 mL;再加入8 mg·L-1 DPPH·溶液2.0 mL;以80%乙醇为空白参比，在517 nm测定各溶液的吸光值A1。取以上各样品溶液2.0 mL，加入2.0 mL 80%乙醇溶液，混合摇匀后在517 nm测定各溶液的吸光值A2。取8 mg·L-1 DPPH·溶液2.0 mL，加入80%乙醇2 mL，517 nm测吸光值。按照下列公式计算对DPPH·自由基的清除率[22-23]。

清除率=[ 1-（A1-A2）/ A0 ]×100%

式中，A1 为各样品溶液与8 mg·L-1 DPPH·溶液混合液的吸光值;A2 为各样品溶液与80%乙醇溶液混合液的吸光值;A0 为8 mg·L-1 DPPH·溶液与80%乙醇溶液混合液的吸光值。

2 结果与分析

2.1 扶芳藤叶中总黄酮的含量

由芦丁标准曲线和总黄酮提取率公式计算可得（表1）：扶芳藤叶总黄酮提取液中，总黄酮含量为0.133 mg·mL-1，提取率为1.33%。

2.2 扶芳藤叶中总黄酮的总抗氧化能力

由图2可知，扶芳藤叶中未稀释总黄酮溶液的总抗氧化性与同浓度的芦丁、VC对照溶液总抗氧化能力相当，并且随总黄酮浓度的增加，其总抗氧化能力增强。扶芳藤叶中的总黄酮具有较好的抗氧化活性。

2.3 扶芳藤叶中总黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力

由图3可知，扶芳藤总黄酮的稀释液在很低的浓度时，对超氧阴离子自由基的清除作用就远高于对照样品芦丁溶液（0.133 mg·mL-1）;4%的扶芳藤总黄酮的稀释液对超氧阴离子自由基的清除率就略高于VC溶液（0.133 mg·mL-1）的清除作用。扶芳藤叶总黄酮对超氧阴离子自由基有很好的清除效果，极大优于VC 和芦丁。

2.4 扶芳藤叶中总黄酮对羟基自由基的清除能力

由图4可知，随溶液中总黄酮含量的增加，扶芳藤叶总黄酮对羟基自由基的清除能力增强，并且未稀释的扶芳藤叶总黄酮（0.133 mg·mL-1）与相同浓度的芦丁相比，其清除率还高于芦丁，但略低于VC溶液。因此，扶芳藤叶中总黄酮对羟基自由基有良好的清除作用。

从生物个体角度看，羟基自由基是毒性非常大的一种自由基，其化学性质比较活泼，可以同生物机体细胞中的很多分子产生化学反应，因而导致机体损害[24]。此试验表明，扶芳藤叶中的总黄酮可通过良好的清除羟基自由基能力来行使抗氧化功能。

2.5 扶芳藤叶中总黄酮对DPPH·自由基的清除能力

由图5可知，扶芳藤叶总黄酮对DPPH·自由基有显著的清除作用，并且随总黄酮浓度的增加，清除率随之增大。其中，未稀释的扶芳藤叶总黄酮对DPPH·自由基清除率高达92.69%，其清除能力高于相同浓度的芦丁溶液，与相同浓度的VC溶液相当。

3 结论与讨论

自由基的含量与生物体的多数功能紊乱和疾病的出现有关。生物机体内的自由基是处于连续的产生与清除的稳定动态平衡状态之中，当这种动态平衡被打破时，机体内的自由基含量增多或是其本身的抗氧化能力减弱时，则可引发机体损伤[25]。因此，探讨抗氧化物质对自由基的清除作用以及效果具有重要意义。

超氧阴离子（O2-）、羟自由基（·OH）、DPPH·是能够引起机体损伤病变的常见自由基。本试验以芦丁和Vc作为对照，研究了扶芳藤叶中总黄酮提取物的体外抗氧化性能。试验结果表明，扶芳藤叶总黄酮提取物可以有效地清除超氧阴离子自由基、羟基自由基和DPPH·自由基，其中，清除超氧阴离子的能力远远优于芦丁和Vc，清除羟基自由基和DPPH·自由基能力与芦丁和Vc相当，因此，扶芳藤叶总黄酮具有较好的体外抗氧化活性。

具有园艺和药用双重价值的资源植物扶芳藤，其育种和栽培容易完成。扶芳藤的茎叶不仅可以作为传统中药材入药，还可以从中提取总黄酮，今后应加强抗氧化剂产品的开发，提高扶芳藤叶深加工的经济价值和扶芳藤植株的综合开发价值。

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