新型免疫佐剂研究进展

赵思俊，孙晓亮，曲志娜，王　娟，曹旭敏，王淑婷，王晓茵，李雪莲（.中国动物卫生与流行病学中心动物产品安全监测室，山东青岛　6603；.青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛　6603）



新型免疫佐剂研究进展

赵思俊1，孙晓亮1，曲志娜1，王娟1，曹旭敏1，王淑婷1，王晓茵1，李雪莲2
（1.中国动物卫生与流行病学中心动物产品安全监测室，山东青岛266032；2.青岛易邦生物工程有限公司，山东青岛266032）

摘要：随着免疫学研究的不断深入，研究开发高效、低毒、副反应小的免疫佐剂具有重要的理论和实际意义。本文对不同类型的新型免疫佐剂的研究现状进行了综述，以期为免疫佐剂的研制提供参考。

关键词：免疫佐剂；纳米佐剂；研究进展

免疫佐剂（immunoadjuvant），又称非特异性免疫增生剂，其本身不具有抗原性，但同抗原一起或预先注射到机体内后，能非特异性地改变机体对该抗原的特异性免疫应答。1925年，法国免疫学家Gaston Ramon[1]第一个制备出明矾沉淀破伤风类毒素，可特异性增强机体的免疫反应，随后国内外学者对免疫佐剂进行了广泛而深入的研究。目前，常见的佐剂有铝佐剂、弗氏佐剂等传统佐剂，以及γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素（Interleukins，ILs）、脂质体、免疫刺激复合物（ISCOMs）、CpG寡脱氧核苷酸、中药多糖、纳米材料等新型免疫佐剂。

铝佐剂和弗氏佐剂是目前被广泛使用的免疫增强佐剂，其作用机理主要是在机体注射部位形成抗原储藏库，使抗原缓慢释放，刺激浆细胞产生抗体。但铝佐剂容易形成肉芽肿，甚至会发生局部无菌性脓肿，引起机体过敏反应；而且铝胶冷冻后容易变性，所以含铝佐剂的生物制品不宜冷冻。而弗氏佐剂中的矿物油不能被机体代谢，容易引起注射部位的炎症反应、肉芽肿、溃疡和发热等副反应，因此该佐剂通常不能用于人类疫苗。随着免疫学研究的不断深入和基因工程技术的迅速发展，科研工作者广泛开展了新型基因工程疫苗、以抗体为核心的新型诊断试剂的研制。为了提高抗原，尤其是小分子抗原的免疫原性，近年来广大学者对新型免疫佐剂进行了研究。本文对近几年来新型免疫佐剂的研究进展进行了综述。

1　新型油佐剂

随着乳化技术的进步，传统矿物油佐剂逐渐被含油比例低的Seppic佐剂或MF59、AS03、AF03 和SE等新型油佐剂所取代。如MF59水包油型乳剂（主要成分为角鲨烯、聚山梨醇酯80和去水山梨醇三油酸酯）是目前研究较为热门的佐剂之一。研究发现，其可依赖于适调蛋白MyD88的非Toll样受体依赖性的信号通路，提高机体体液免疫反应的水平，可同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫[2]，并于1997年被欧洲批准作为流感疫苗佐剂使用，目前已广泛用作各种亚单位疫苗佐剂。

2　脂质体

脂质体（liposome）作为药物载体和疫苗载体，可促进树突状细胞等抗原呈递细胞对抗原的摄入，进而发挥免疫佐剂作用。由于脂质体中的磷脂酰胆碱等是细胞膜的正常成分，可以被生物降解，所以其本身无毒性且没有免疫刺激效应。脂质体的大小、脂类组成以及所带电荷是影响其发挥免疫佐剂性能的重要影响因素。Bal等[3]将卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）分别与免疫增强剂PAM和非甲基化的CpG寡核苷酸包裹于脂质体中进行测定，结果表明包裹于脂质体的免疫增强剂刺激树突状细胞成熟的能力较游离的免疫增强剂更强；且“OVA+CpG”脂质体组较CpG处理组，更能在小鼠机体内产生IgG2a，并能显著促进小鼠体内IFN-γ的分泌。Aramaki等[4]用BSA脂质体鼻内免疫Balb/c小鼠。结果表明：特异性血清IgG和唾液IgA水平显著升高，而只用BSA免疫的小鼠，其IgG、IgA水平未见明显升高；无论脂质体带正负电荷或不带电荷，均可使IgA水平显著升高，表明黏膜免疫的活化与脂质体电荷无关。

然而，由于脂质体稳定性较差，在一定程度上影响其在疫苗领域的广泛应用，因此，国内外学者通过脂双层头部反应基团的聚合、磷脂酰尾部反应基团的聚合等方式提高单层或多层脂质体的稳定性[5-6]。Moon等[7]采用一种脂双层间交联的多层脂质体载体（interbilayer crosslinked multilamellar vesicles，ICMVs）包裹蛋白质，使蛋白质在较长时间内维持在一个较高的浓度水平，其在血清环境中释放包裹物的速度变得极慢，进而发挥免疫增强作用。

3　免疫刺激复合物

免疫刺激复合物（immunostinulating complex，ISCOM）是由皂甙、胆固醇、磷酸类酯相互作用形成的一种笼状的结构，是一类抗原传递系统的佐剂。ISCOM与蛋白质或其它免疫原分子混合，通过表面疏水作用捕获蛋白抗原，通过内吞作用被APC摄取。在动物实验中，ISCOM可诱导强的Thl和Th2免疫应答，具有较好的靶向性和呈递作用，能诱生较为明显的主要组织相容性复合物I类分子限制性细胞毒性T细胞应答[8]。ISCOM发挥免疫增强作用时所需的抗原量很少，所以可作为亚单位疫苗的有效佐剂。研究表明，ISCOM是目前诱导细胞毒性T淋巴细胞作用最强的免疫刺激物[9]。ISCOM具有佐剂和抗原提呈的双重功能，可同时激发细胞介导的免疫反应和体液免疫。

4　细胞因子佐剂

细胞因子是由活化的免疫细胞（单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和其他非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质。研究表明，IL-12、IL-2、IFN-γ能有效增强CTL、自然杀伤细胞活性和抗原提呈作用，促进细胞毒性T淋巴细胞免疫应答。IL-2可促进T细胞增殖，维持T细胞在体外生长，故又称为T细胞生长因子。IL-2还可作用于T细胞、B细胞、巨噬细胞和NK细胞等多种免疫细胞，促进机体免疫应答[10]。IFN-γ分子量小，可自由出入细胞，作用无特异性，可增强T细胞、B细胞和NK细胞的活性[11]。

5 CpG寡脱氧核苷酸

CpG寡脱氧核苷酸（CpG oligonucleotide，CpG-ODN）是含有非甲基化CpG胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的脱氧核苷酸，也被称作CpG岛，是细菌DNA产生免疫刺激作用的核心序列结构[12-14]。CpG DNA可促进B细胞增殖分化，并分泌IL-6，激活抗原递呈细胞分泌多种细胞因子，进一步促进CTL和NK细胞的活性，从而诱导机体产生细胞免疫[14]。研究表明，CpG DNA与氢氧化铝佐剂具有协同作用，可有效增强肿瘤抗原、鸡蛋溶菌酶、卵白蛋白、流感疫苗等抗原的免疫效果[15]。非甲基化CpG DNA具有免疫刺激活性，能诱导Thl型免疫应答和CD8 T细胞免疫应答[16]。总之，CpG DNA具有独特的免疫增强作用和免疫记忆增强作用，可以增强体液和细胞免疫应答。CpG DNA可以促进全身或局部黏膜的抗微生物作用，诱导机体产生更快速、更强烈、更有亲和力和更持久的体液和细胞免疫应答。

6　多糖佐剂

多糖（Polysaccharides）由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类具有广泛生物活性的生物大分子物质，又称多聚糖。中药多糖特别是补益类中药多糖一般都有增强机体免疫功能的作用，是良好的生物反应调节剂；具有佐剂活性的多糖主要包括黄芪多糖、当归多糖、灵芝多糖、党参多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖等。柳仲勋等[17]以当归多糖和当归内脂作为乙型肝炎基因工程苗的佐剂，免疫效果明显优于铝佐剂。马兴铭等[18]研究了枸杞多糖、猪苓多糖、茯苓多糖、灵芝多糖、黄芪多糖、当归多糖对小鼠巨噬细胞功能的影响，结果显示，6种多糖都能显著增强噬中性粒细胞的功能，提高细胞免疫力，且枸杞多糖增强巨噬细胞功能的作用明显优于其他中药多糖。

7　纳米佐剂

纳米佐剂（nano-particulate adjuvant）即为用纳米材料做成的免疫佐剂。纳米粒子一般为粒径小于100 nm的超微粒子。纳米粒子具有比表面积大、表面活性中心多、反应活性高、吸附和催化能力强的特点，因此会产生体积效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应[19]；且纳米粒子具有很好的生物相容性，能够持续释放抗原，使机体抗原维持在有效浓度。此外，纳米粒子能够对其表面性质进行修饰，可以使其引入功能分子。如具有靶向性的配体可以靶向到特定的细胞或者其他成份，使纳米佐剂在免疫后能有效运输到相应的免疫细胞[20-22]。所以，用纳米材料作免疫佐剂往往具有许多常规佐剂不可比拟的优势。

纳米佐剂可分为无机纳米佐剂和有机纳米佐剂。如氢氧化铝纳米佐剂、磷酸钙纳米佐剂、活性炭纳米佐剂等属于无机纳米佐剂；而壳聚糖及其衍生物纳米佐剂、聚丙交酯乙交酯纳米佐剂、蜂胶纳米佐剂、多糖纳米佐剂等为有机纳米佐剂。下面以纳米磷酸钙和纳米壳聚糖为例，分别阐明了无机纳米佐剂和有机纳米佐剂的特点。

7.1纳米磷酸钙

与铝佐剂等传统佐剂相比，磷酸钙具有良好的生物安全性，在生物体内可被有效降解，而且对注射部位无刺激作用，是较为理想的佐剂材料之一[23]。然而，磷酸钙的合成工艺是影响其在临床广泛应用的瓶颈。He等[24]将疱疹病毒蛋白包裹于粒径小于1 μm的磷酸钙颗粒，并免疫小鼠，检测发现纳米级的磷酸钙作为免疫佐剂可有效刺激机体产生高滴度的IgG及抗体，能较好地保护机体免受疱疹病毒的感染，且对注射部位未产生明显的红肿热痛等副作用。

7.2纳米壳聚糖

壳聚糖是一种廉价天然聚合物分子，生物相容性好，可生物降解。纳米壳聚糖对各种抗原的负载率很高，且具有一定的免疫活性，因此其在药物和疫苗传输载体中具有极大的应用前景。由于IL-2可有效刺激活化T细胞的分化和增殖，激活单核细胞和巨噬细胞从而清除细菌等病原体，促进自然杀伤细胞（naturalkiller cells，NK）的细胞毒作用等。Yang等[25]将IL-2的质粒DNA包裹于壳聚糖中，与副伤寒疫苗联合免疫小鼠，结果显示，与裸DNA免疫组相比，其显著提高了机体的细胞免疫和体液免疫水平，保护小鼠免受沙门氏菌的攻击。也就是说，壳聚糖包裹IL-2质粒DNA后，使DNA免受核酸酶降解，且使得IL-2发挥了良好的免疫佐剂作用。张馨玉等[26]系统研究了壳聚糖作为口蹄疫疫苗载体在不同免疫方式中的免疫效果，分别以滴鼻、口服、直肠和生殖道等4种黏膜免疫途径进行免疫。结果显示，经滴鼻和直肠途径免疫，纳米壳聚糖佐剂可显著促进机体产生抗体。

8　结语

开发研制新型免疫佐剂、增强抗原的免疫效力、减少毒副作用，将是免疫学科研工作者追求的目标。理想免疫佐剂应当能够诱导机体增强细胞或体液免疫的强度以达到保护要求；对动物或人类，副作用最小，且免疫作用持久稳定。同时，在选择免疫佐剂时，既要发挥免疫佐剂的特性，又要综合考虑与其毒性作用的最佳平衡点。随着研究的不断深入，尤其是纳米技术在生命科学领域的广泛应用及其潜在的巨大优势，纳米佐剂将是今后疫苗佐剂研究的一个重要方向，尤其是对于同时具有免疫刺激和载体特性的纳米佐剂的筛选、佐剂活性产生的机理、动物模型建立等方面的研究。

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（责任编辑：杜宪）

Study Progress of New Type of Immunoadjuvant

Zhao Sijun1，Sun Xiaoliang1，Qu Zhina1，Wang Juan1，Cao Xumin1，Wang Shuting1，Wang Xiaoyin1，Li Xuelian2
（1. Department for Safety Supervision of Animal Products，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Qingdao Yebio Biological Engineering Co.，Ltd.，Qingdao，Shandong 266032）

Abstract：With the development of immunology research，important theoretical and practical significance of the study of immunological adjuvant，with the characteristics of high efficiency，low toxicity and small adverse，were found out. In this paper，the research progress of different types of new immune adjuvant was reviewed，in order to provide a reference for developing immunoadjuvant.

Key words：immunoadjuvant；nano-particulate adjuvant；progress

文献标识码：S859.79中图分类号：B

文章编号：1005-944X（2016）07-0058-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.07.019

基金项目：中国动物卫生与流行病学中心创新基金项目（2014IF-003FF）

通讯作者：李雪莲