酿酒酵母基因工程菌的构建及工艺优化研究进展

李 媛 张爱丽 周 伟 钱子刚



药物研究

酿酒酵母基因工程菌的构建及工艺优化研究进展

李 媛 张爱丽 周 伟 钱子刚

云南中医学院/中药材优良种苗繁育工程中心，云南 昆明 650500

酿酒酵母是合成天然产物的重要宿主菌，但在酿酒酵母中构建遗传稳定性好、基因表达可控的代谢途径并获得高产菌株仍然是代谢工程和合成生物学中的难点，笔者系统介绍了目前酿酒酵母工程菌的构建及发酵条件优化的研究进展为其代谢与合成提供一定的参考。

酿酒酵母；表达系统构建；发酵优化；合成生物学

酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为酵母科酵母属，单细胞真核微生物，细胞形态多呈卵形或者球形，直径 5～10μm，以出芽生殖方式进行无性繁殖。其以研究背景清晰、代谢繁殖快、安全无毒、不致病等优点被广泛应用于食品与医疗卫生领域[1]。早在1996年已完成了对酿酒酵母的全基因组测序工作，其基因组包含16条染色体，全长为12068kb[2]。近年来，经国内外学者研究报道，酿酒酵母菌已经成为一种重要的模式生物被广泛的应用于基因工程、蛋白表达及遗传学分析等研究领域[3-4]，并围绕酵母菌开展了酵母基因敲除技术、酵母基因定位技术、酵母功能基因芯片技术、酿酒酵母双杂交技术等[5]。值得注意的是，由于酵母菌是最简单的真核生物，而利用酵母菌表达动植物基因能在相当大的程度上阐明高等真核生物基因表达调控的基本原理以及基因编码产物结构与功能之间的关系，从而起到异源表达或鉴定目的蛋白的作用[6-7]，所以越来越多的学者致力于通过构建酿酒酵母工程菌，建立酵母表达系统，并通过对发酵工艺的优化得到高产菌株，合成细胞工厂以发酵生产植物源天然产物[8]。笔者将着重介绍近年来构建的酿酒酵母基因工程菌在表达系统中的应用及酿酒酵母发酵工艺优化的研究进展。

1 酿酒酵母表达系统的研究进展

目前构建酵母工程菌的途径主要有两种：一是在酵母底盘细胞中人工构建目的产物的合成途径，以实现快速大量的生产重要药用有效成分或其中间体；二是基于合成途径分支点的特点，通过抑制或下调目标途径的竞争途径以达到目的产物大量表达的方法。

1.1 酿酒酵母基因工程菌合成途径的构建 酿酒酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，培养条件简便，生长繁殖迅速，在表达基因工程产品时，可以大规模生产，且成本低廉，特别适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具[9]。

酿酒酵母自身存在甲羟戊酸途径，而该途径的中间代谢物2,3-氧化角鲨烯恰恰为萜类物质提供了关键的前体物质，被认为是萜类合成最适宜的底盘宿主[10]。戴住波等[11-12]已在酵母底盘细胞中人工构建了原人参二醇的合成途径，实现了从单糖到稀有人参皂苷CK的生物合成。王贝贝[13]通过对酿酒酵母甲羟戊酸途径中的限速酶过表达后，将成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素的合成基因整合至酵母中，最终获得了高产β-胡萝卜素的酵母工程菌。可见，构建代谢工程菌株，能快速大量的生产重要药用有效成分或其中间体，为濒危药材的保护和可持续利用提供应用基础[14]。林庭庭[15]等将拟南芥中的羽扇豆醇合成酶基因整合到三萜底盘菌株中，创建了羽扇豆醇酵母人工细胞工厂，并获得高产羽扇豆烷型三萜。王乐[16]在西洋参中以酿酒酵母菌作为受体菌分别构建了原人参二醇合成酶基因、原人参三醇合成酶基因与达玛烯二醇合成酶基因的异源表达载体，并将各异源表达载体分阶段转入同一酿酒酵母细胞中获得异源共表达工程菌，经检测其产量可达13.85μg/g FW，表明酿酒酵母菌为药用植物中的皂苷异源代谢合成提供了天然的表达系统，也为通过代谢工程手段实现皂苷的异源工业化生产提供了研究思路。1.2 酿酒酵母基因工程菌竞争途径的调控 当外源途径在酿酒酵母底盘细胞中成功组合、表达后，目的产物的合成依然还受酵母内源代谢途径的干扰，因此对于酵母内源竞争途径的调控显得十分重要。

张根林[10]对β-香树脂醇的研究报道中指出，除了存在MVA途径下游的FPP、鲨烯分支代谢外，至少还存在两个竞争代谢分支，一个是维持细胞正常生长必需的甾醇合成途径，一个是胞质乙酰辅酶A的合成与代谢途径。所以张根林在酿酒酵母中构建了β-香树脂醇的合成途径后，通过下调竞争β-香树脂醇合成的内源甾醇和乙酰辅酶A的代谢分流，用“推拉式”措施优化使得β-香树脂醇的产量大幅提高。谢文平[17]构建一种基于类胡萝素颜色的启动子强度表征系统，用于酿酒酵母中不同强度启动子的表征，其中通过弱启动子对竞争性代谢支路下调，以实现类胡萝卜素的高产。

在异源宿主进行目的产物合成时，为提高目标途径的代谢通量，增加前体物质的产量也是关键之一。徐国强[18]为了提高延胡索酸的产量，首先敲除调控乙醇合成途径中的关键基因，从而减少了乙醇的代谢通量获得合成延胡索酸的大量丙酮酸前体物质，并构建了胞质还原途径，通过克隆酿酒酵母自身存在的丙酮酸羧化酶基因过表达延胡索酸。且利用基因组规模代谢网络模型分析，通过敲除自身的关键基因，使得通过氧化途径进一步积累延胡索酸。

2 酿酒酵母发酵工艺的优化研究进展

微生物发酵优化包括分子、细胞和反应器三个层次，国内外研究者通过代谢工程和合成生物技术构建了酿酒酵母工程菌株，但为了获得高产菌株，发酵过程的控制与优化是实现代谢产物规模化生产的必要环节[10]。而适宜的发酵条件必须包括以下几点：①培养基应具备一定的稳定性且价格低廉；②在发酵培养基确定的情况下，适当调控酿酒酵母工程菌高密度发酵的重要参数，如接种量、温度、pH值、通气量等，可获得高产目的代谢产物；③筛选最适合酿酒酵母工程菌培养的方式也是获得高产菌株的关键因素之一。

2.1 酿酒酵母工程菌发酵培养基的筛选 酿酒酵母发酵工艺优化的一方面是为了在优化发酵条件后获得高产的酵母工程菌，另一方面是为了实现大规模的工业化发酵。优化工艺首先是需要选择适宜的培养基，最优的培养基应满足在发酵过程中不会产生有毒代谢物质，所产生的代谢副产物较少。同时应具备一定的稳定性，便于应用于大规模生产，并且需要保证不会因培养基自身原因影响目的代谢产物的提取和分离。对于培养基中的氮源、碳源、有机酸及金属离子等因素的筛选也是优化培养基的关键之一，当氮源、碳源的浓度过低或过高时均不利于目的产物的累积。施明雨[19]选用了无机盐培养基为高密度发酵培养基，同时限制了磷酸盐的供给，在细胞生长对数期时添加有机萃取剂，使番茄红素的产量提高了10.2倍，原人参二醇产量提高了10.5倍。王冬[20]通过对YDP培养基的初糖浓度进行优化研究，表明在葡萄糖浓度为40 g/L时可获得最高生物量，而当其浓度超过此浓度后会受到发酵过程积累的高浓度乙醇抑制，从而影响工程菌的生长及目标产物的合成。所以对于成功的酿酒酵母工程菌的发酵，培养基的优化是十分关键的。

2.2 酿酒酵母工程菌发酵重要参数的优化 影响酿酒酵母工程菌高密度发酵的因素很多，如培养温度、pH值、通气量、接种量、转速、摇瓶发酵时间等，在发酵培养基确定的情况下，适当的调整这些因素可获得较高产量的代谢产物。刘志友[21]通过对番茄果酒主要影响因子如初始糖度、酵母接种量、pH和温度进行了正交优化试验，结果获得了达到果酒感官理化卫生标准的番茄果酒。

2.3 酿酒酵母工程菌培养方式的筛选 目前细胞高密度培养方式主要有细胞循环培养和透析培养、补料分批培养等，其中，补料分批培养对生长偶联产品和胞内产品的生产有很大的帮助。对于补料分批培养的研究是实现自动化控制的前提[19]。张根林[10]使用乙醇补料批式发酵，使得β-香树脂醇的产量提高了90.2%。

3 存在的问题和展望

尽管国内外学者在酿酒酵母底盘细胞中构建了许多工程菌，并成功表达外源蛋白且获得高产菌株，但依然存在一些问题值得深思：①依然存在部分外源基因不能在酿酒酵母表达系统中表达，而具体原因尚未明确；②对于较长途径中的表达效率较低；③没有彻底克服产物蛋白不均一的现象；④对于发酵过程中，有关酿酒酵母自身的乙醇耐性、耐低温、耐高渗等耐受性的机理还尚不清楚，有待研究。

为成功构建代谢途径并能在细胞中稳定遗传，可通过从动植物中克隆代谢途径中的多个关键酶基因，不再是单一的启动子-基因-终止子组成的表达盒导入酿酒酵母细胞中进行基因的过表达，而是通过调控多个目标酶的催化效率从而获得稳定遗传的工程菌株。另外，目前已有关于优化密码子的研究报道[16]，未来可通过优化密码子影响代谢途径从而提高外源酶基因在酿酒酵母工程菌中的表达效率。而关于酿酒酵母自身耐受性研究报道，目前主要集中在乙醇耐受性，已发现细胞壁、细胞膜等细胞结构与乙醇的耐受性有关[22-23]，且通过对酿酒酵母非必需基因的敲除可提高乙醇的耐受性[24]。因此可通过加强对细胞代谢工程、基因组学以及蛋白组学的研究，从而获取更多相关基因信息，为各种耐受性的机理研究奠定基础。

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(编辑：梁志庆)

Current progress on the construction and optimization of genetically engineeredSaccharomycescerevisiae

LI Yuan ZHANG Aili ZHOU Wei QIAN Zigang*

Engineering Research Center for Reproducing Fine Varieties of Chinese Medicinal Plants, Yunnan University of Traditional, Chinese Medicine, Kunming 650500, China

Saccharomycescerevisiaeis an important heterologous host for the synthesis of natural products. However, the construction of genetically stable, high-yielding strains ofS.cerevisiaewith controllable metabolic pathways remains a significant challenge in synthetic biology. In this review, we provide an overview of the current progress on the construction of genetically engineered S. cerevisiae and the optimization of fermentation conditions,to prouide a reference for its metavolism and synthesis.

SaccharomycesCerevisiae; Expression System Construction; Fermentation Optimization; Synthetic Biology

2016-08-23

国家自然科学基金(NO: 81260609)；云南省教育厅重点项目(NO: 2015119)；云南省教育厅科学研究基金项目(NO:2015J101)。

李媛(1991-)，女，汉族，硕士研究生在读，研究方向为中药资源开发与利用。E-mail:365408783@qq.com

钱子刚(1962-)，男,汉族,教授,硕士生导师。E-mail: qianzig@ailiyun.com

R714

A

1007-8517(2016)18-0005-03