单核苷酸多态性(SNP)分型的主要方法及研究进展

刘　健，宋倩倩，翁巧琴，张金枝*

(1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.余姚市欣农兔业有限公司)



单核苷酸多态性(SNP)分型的主要方法及研究进展

刘健1，宋倩倩1，翁巧琴2，张金枝1*

(1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.余姚市欣农兔业有限公司)

近年来，随着现代分子生物学的发展，遗传标记也在不断的发展与进步。目前，基因的单核苷酸多态性(SNP)已成为继RFLP，SSR之后的第三代分子遗传标记[1]。

SNP是指在基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基转换、颠换、插入及缺失等形式，具有数量丰富，分辨率高，覆盖基因组范围大，遗传稳定等主要优点。因此，SNP可广泛应用于农学、医学及生物进化等相关领域，作为稳定的分子遗传标记从而开展相关研究。本文主要介绍SNP分型的常规方法，部分方法的改良及国内外SNP分型方法的研究进展。

1PCR-SSCP法

DNA的单链构象多态性(SSCP)是指含点突变的DNA小片段在中性聚丙烯酰胺凝胶中的单链电泳迁移率与相应正常的DNA小片段的单链电泳迁移率明显不同。

基本原理：经PCR扩增的DNA片段在变性剂或低离子浓度下，经高温处理使之解链并保持在单链状态下，单链DNA迁移率除与DNA长度有关外，主要取决于DNA单链所形成的空间构象。因此，含有点突变的DNA单链同正常的DNA单链相比，其在中性聚丙烯酰胺凝胶中的单链电泳迁移率完全不同，即可划出DNA单链中的SNP位点。

操作步骤：PCR扩增靶DNA；将特异的PCR产物变性后，迅速冰浴，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；将适量单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA带迁移率，且与正常对照相比发生改变，就可判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。

主要优点：可以检测任何(包括已知和未知)DNA位点上的多态性和突变；无需事先知道待测DNA片段的序列，只要能根据已有数据设计PCR引物即可进行PCR-SSCP分析；实验操作简便，周期短，成本低；更适于功能基因研究[2]。

主要缺点：不能对DNA序列变异进行精确定位,只能对其进行初筛，当DNA片段大于400 bp时容易出现假阴性及假阳性等[3]。

根据PCR-SSCP基因分型方法，可以很快完成对DNA片段进行初步筛选，但也不能忽视其不能精确定位的缺点，针对PCR-SSCP技术存在的问题，科研人员进行了进一步探索，采用荧光标记PCR-SSCP技术[4]，限制性内切酶指纹SSCP技术[5]及低离子强度PCR-SSCP技术[6]，一定程度上改善了PCR-SSCP技术在应用中的问题，提高了检测效率。

2PCR-CTPP技术

该技术又称四引物扩增受阻突变体系，是一种可用于SNP分型的新型技术。

基本原理:利用Taq DNA聚合酶缺少3′→5′外切酶校正活性,当引物3′末端错配时延伸效率明显降低,导致扩增受阻；针对已知突变,在突变点两侧设计巢式引物:一对外引物和一对特异性内引物,内引物的3′终末端须落在突变位点上,根据扩增片段的大小和数量检测突变是否发生。PCR-CTPP引物设计是决定该技术检测灵敏度的关键。引物的3′末端碱基必须落在突变位点上,该碱基可与野生型基因序列完全互补,而与突变型不匹配；也可与突变型互补而与野生型不匹配,但3′端最后碱基必须在突变位点上,否则就不能准确判断突变是否发生。

主要优点：可以快速检测SNP位点，可准确找到突变位点，且实验操作简便，成本较低。

主要缺点：由于Taq DNA聚合酶具有5′→3′外切酶活性，所有外引物引导的延伸会对同向内引物及其延伸产物阻碍其引导扩增，破坏其扩增产物的形成。实际应用时只能通过控制实验条件来尽量减小这一缺陷对实验结果所造成的影响。针对本技术存在的缺陷，解决办法主要是在引物的3′末端倒数第二位或第三位引入人为错配可以有效提高SNP分型的特异性,以避免假阳性造成的误判等[7]。

针对PCR-CTPP技术，国内外科研人员进行了大量试验与创新以提高其检测的特异性。其中日本名古屋大学报道的OPA-CTPP技术[8]，可在常规PCR-CTPP技术分型不是非常明显的情况下采用本法后可得到较为清晰的电泳图谱。试验发现，在使用PCR-CTPP法检测SNP位点时，由于四个引物的Tm值不同，进而引起DNA片段的不平衡扩增，导致PCR扩增过程中很难产生想要的特定片段。针对该缺陷，名古屋大学Guang等(2012)[8]在两对引物的5′末端各加了一段共同序列，并对这一共同序列在反应体系中又加入了一个引物，这样在整个反应体系中就存在5个引物，相对于常规的PCR-CTPP方法增加了一个引物，因此就将此方法命名为OPA-CTPP法。另据王柯等(2011)[9]报道，其改良PCR-CTPP技术的方法是在引物设计时, 使两个内引物的Tm值稍高；在PCR早期循环中,设置较高的复性温度,抑制外引物的复性,使内引物引导的片段优先扩增；再降低到折中的复性温度进行扩增。该法主要是减少外引物引导的延伸对同向内引物及其延伸产物产生阻害作用，进而使试验结果更加准确，以提高SNP的检出率。

3等位基因特异性杂交(ASH)

该方法主要根据核苷酸探针和互补的目的片段进行杂交时完全匹配和有错配两种情况下杂交复合体稳定性的不同而完成SNP位点检测。包括等位基因特异核苷酸片段分析(ASO)、基因芯片和动态等位基因特异性杂交(DASH)等。

基因芯片技术(Genechips)的基本原理是利用寡核苷酸与不同靶序列变异配对的杂交稳定性存在着差异，将微电子芯片制造技术与杂交荧光显色技术结合在一起,在一小块硅片上高密度地集成上万乃至更多的探针形成多重寡核苷酸微阵列，通过与目的DNA的杂交显色反应等方法检测SNP[10]。

动态等位基因特异性杂交(DASH)其原理是首先将标记有荧光染料的探针与目标序列进行配对,当达到变性温度时,荧光强度迅速减弱；存在错配碱基的互补双链变性温度低于不含错配碱基的双链；通过测定互补双链的变性温度可以判断互补双链中是否含有错配碱基。

4内切酶酶切技术

该技术的基本原理是限制性内切酶是一种可识别DNA特异位点,并在特异位点进行切割的酶类,对特异DNA位点的切割可产生特定相同的片段序列,当存在SNP时,碱基的替换可产生或消除限制性内切酶的位点从而使酶切产物的大小及数目存在差异，其中最典型、应用最多的技术是PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性)技术及引物入侵技术(Invader assay)，UCAN等。

引物入侵技术的基本原理是每一反应体系包括一对等位基因特异性探针和一条位于待测SNP位点上游的入侵探针纵向杂交到DNA特异区域。如果等位基因特异性探针与目标序列完全互补,则与入侵探针的3′端在SNP位点处重叠, 靶特异切割酶就能识别这种三级结构(精确入侵结构)并切除5′端,被切除的尾序列带有荧光标记,又可作为入侵探针参加下一轮反应。最后,通过检测荧光信号来区分等位基因的类型[11]。

UCAN法采用插入一段RNA的DNA作为聚合酶反应的引物，引物的3′末端被化学基团封阻，反应中用到了RNase H。在进行SNP检测时，若靶DNA和引物中的RNA完全配对匹配，RNase H消化引物RNA部分而去除封阻的3′末端，使DNA聚合酶的延伸反应得以进行。根据延伸反应进行与否就可实现对SNP的检测。

5质谱法

质谱法(MS)测定的是DNA分子基本性质(产物的分子量)，是最直接的检测方法，不需任何标记物。高分辨率的MS可轻易区分仅相差一个碱基的DNA分子。另一优点是分析每个样品只需数毫秒，即使逐个分析每个样品，检测通量仍然很高。通过合理的设计探针，可实现中度的多重化。

MS方法的最大缺点是对分析样品纯度要求苛刻。随着产品纯化过程的改进则可克服这一缺点。

6TaqMan ASO(5′nuclease assays)

该技术主要利用TaqDNA聚合酶的5′→3′核酸外切酶特性降解下游与累积扩增产物退火探针的特点，系统采用3个引物，除2个常规引物P1和P2外，还有第3个引物P3，其两端分别用报告剂和淬灭剂标记，5′端与可能的SNP配对，3′端被封阻，不能引发DNA合成，与P1下游1个位点特异序列结合。扩增时Taq酶由P1引导合成新的DNA链，到P3时，如果P3与靶DNA完全配对，其外切酶能力逐渐从5′ 端降解P3，使报告染料解离而发光。

检测结果，如果P3的5′与靶DNA有错配，则不能切割淬灭剂和发光。将计算机与TaqMan ASO结合起来的PCR方法，提高了自动化程度，可使每人每天检测1000个以上的SNPs[12]。

7其他分型方法

2012年，第三军医大学的科技人员介绍了一种新型SNP分型方法-Gap-LCR-PCR技术的改进方法[13]，这种方法使SNP分型变得更加快速与经济。2008年，中国医科大学王瑞恒等介绍了一种基于等位基因特异性PCR原理的SNP分型方法-FLDASFLM-PCR法[14]，这种方法可同时进行多位点SNP分型，因此大大提高了SNP的分型效率。

另外，近年来发展的变性高效液相色谱(DHPLC)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALD-TOF MS)、动态等位基因特异性杂交(DASH)等方法也可完成SNP的分型，这些新技术具有通量高、易于自动化等优点，但仪器设备成本昂贵。

SNP研究是目前人类基因组研究的热点,其应用范围将更加宽广,对群体遗传学、制药学、法医学、癌症及遗传性疾病，甚至进化研究等都将产生不可估量的影响。目前，SNP分型方法多种多样。在这些方法中，一部分是发掘SNPs，而另一部分只能检测已知但不能发现新的SNPs。较为理想的SNP检测方法应具备以下优点:一是适合于自动化操作,简便快速；二是分析费用相对较低,所用特殊试剂较少；三是反应精密,不纯样品也可进行可靠分析；四是数据分析简化,易于自动化；五是反应通量大而灵活。当然，每种检测方法都有其优点，也都存在着缺点。但到目前为止，还尚未出现符合上述全部条件的理想方法。因此，试验研究时必须根据特定情况，选择最佳方法，争取最好试验结果。随着现有SNPs检测技术的不断完善及新SNPs检测技术的不断发现，特别是高通量、低成本和高精度DNA测序新技术和微阵列技术，有朝一日将满足上述标准，大大推动相关领域的发展。

参考文献

[1]陈秋玲,高建明,罗峰.分子标记技术在禾本科作物基因定位上的研究进展[J].中国农学通报,2010(9):42-48.

[2]李玉梅,姚纪元,吴静,白秀娟.PCR-SSCP技术的研究及应用进展[J].生物技术通报,2007,06:71-74.

[3]陈强,陈云贵,王根林,等．HSP70基因PCR-SSCP实验条件的优化[J].畜牧与兽医,2008,40(2):66-67.

[4]SOMMER S S，YAN J，LI W，et al．Candidate gene analyses by scanning or brute force fluorescent sequencing，a comparison of DOVAM-S with gel-based and capillary-based sequencing[J].Genet Test，2007，11(3)：235-240.

[5]MARUYA E，SAJI H，YOKOYAMA S．PCR-LIS-SSCP (Low ionic strength single-stranded conformation polymorphism)-a simple method for high-resolution allele typing of HLADRB1-DQB1，and-DPB1[J].Genome Res,1996,6(1):51-57.

[6]BRINKMANN N，MARTENS R，TEBBE C C，et al．Originand diversity of metabolically active gut bacteria from laboratory bred larvae of Manduca sexta[J].Appl Environ Microbiol，2008，74(23)：7189-7196.

[7]Little S. In : Taylor G. ed. Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms in DNA, CRC Press[J]. Boca Raton,1997, 45-51.

[8]Guang Yin,Yoko Mitsuda,Takayuki Ezaki,et al.A New PCR Method: One Primer Amplification of PCR-CTPP Products [J].Mol Biotechnol,2012,52:180-183.

[9]王柯,章金涛,运玉霞,等.PCR-CTPP:一种基于错配技术的SNP分型方法的改良[J]. 遗传,2011,2:182-188.

[10]Cortes A, Brown M A . promise and pitfalls the lmmuochip [J].Arthritis Res Ther,2011,13(1):101.

[11]Willkins SP, Hall JG, Lyamiehev V, et al. Analysis of single nucleotide polymorphism typing with solid phase invasive cleavage reactions [J]. Nucleic Acids Res, 2001, 29:E77.

[12]张素华, 李莉, 李成涛,等. Taq Man探针技术用于X-SNP位点的分型[J]. 法医学杂志,2010,26(1).

[13]Ping Yi, Hongmei Jiang, Li Li, et al. A New Genotyping Method for Detecting Low Abundance Single Nucleotide Mutations Based on Gap Ligase Chain Reaction and Quantitative PCR Assay [J]. Cell Biochem Biophys,2012,62:161-167.

[14]王瑞恒,刘利民,赵金玲,等. 基于等位基因特异性PCR原理建立的SNP分型新方法[J]. 法医学杂志,2008,3:189-193.

收稿日期：2016-01-26

基金项目：浙江省(畜禽)新品种选育重大科技专项(2012C 12906-6)和宁波市科技局资助项目(201201C8000037)

作者简介：刘健(1990-)，男，山东潍坊人，硕士研究生，主要研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail:liujian1990@zju.edu.cn*通讯作者：张金枝(1966-)，E-mail:zkangizs@zju.edu.cn

中图分类号：S813.1

文献标识码：A

文章编号：1005-7307(2016)03-0012-003