胶体金免疫层析试纸条在禽病检测方面的应用与展望

秦立得，南文龙，陈义平（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛　266032）

胶体金免疫层析试纸条在禽病检测方面的应用与展望

秦立得，南文龙，陈义平
（中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛266032）

胶体金免疫层析试纸条作为检测工具，具有特异性强、使用方便、结果易于判断等优点，被广泛应用于基层和现场检测。目前，已研发出多种应用于禽病抗原和抗体检测的胶体金免疫层析试纸条。本文从胶体金免疫层析试纸条的技术原理、研究进展及发展方向等方面进行简要综述。

胶体金免疫层析试纸条；禽病；研究进展；展望

胶体金免疫层析试纸条（Immunochromatographic Strip，ICS/Colloid Gold Strip，CGS），通常简称为胶体金试纸条，是通过胶体金免疫层析技术制备的，可以准确、快速、低成本检测抗原或抗体的试纸。1857年，法拉第最早用还原法制备出胶体金溶液。1971年，Faulk和Taylor［1］用与胶体金结合的兔抗沙门氏菌血清，检测沙门氏菌表面抗原的分布，首次将胶体金应用于免疫分析领域。1990年，Osikowicz 和Beggs等建立了胶体金免疫层析技术，并应用于人类绒毛腺激素的定性检测。目前，胶体金试纸条在病原、抗生素、农药残留等检测方面已得到了广泛应用。

在禽病检测方面，胶体金试纸条作为一种检测工具，应用于疾病的诊断、流行病学调查、免疫方案制定、检验检疫等方面。与其他免疫学和分子生物学检测方法相比，胶体金试纸条具有无需专业仪器，检测耗时短，通过肉眼观察即可判定结果，较好的特异性和敏感性，易于运输和保存，适用于基层和现场检测。

1　检测原理

胶体金试纸条以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，通过反应后产生的肉眼可直接观察的颜色变化来判定结果。在禽病检测方面，大部分胶体金检测试纸条采用双抗夹心法检测病原或双抗原夹心法检测抗体。这两种方法基本原理相同，均以条状的纤维层材料为固相载体，以玻璃纤维膜来容纳金标抗体或抗原，将已知的特异性抗原或者抗体固定于硝酸纤维素膜上作为检测线，同时在检测线附近固定可与金标物相结合的抗原或抗体作为质控线。进行样品检测时，在样品垫上滴加待检测样品后，玻璃纤维膜中的胶体金标记抗体或抗原会与待检测目的抗原或抗体结合形成金标复合物，当金标复合物泳动至检测线时，构成检测线的无色检测物与胶体金标记复合物结合，检测线颜色变为红色或紫红色；若样品中不含目的抗原或抗体，则检测线不变色。

2　禽病检测方面的应用

2.1 禽流感

禽流感由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）感染所致，对禽养殖业及人类健康构成了严重威胁。根据AIV囊膜上血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）不同，可分为16个HA亚型和10个NA亚型［2］。

在AIV抗体检测方面，崔尚金等［3］用灭活的H5N1禽流感病毒和杆状病毒表达HA蛋白研制了检测H5亚型AIV抗体的胶体金试纸条，使用该试纸条和血凝抑制实验同时检测830份H5N1 AIV免疫鸡血清样品，与血凝抑制实验结果相比，该试纸条检测灵敏度为88.8%，符合度为97.6%；其中检测免疫60天后血清样品时，该试纸条灵敏度和特异性与血凝抑制实验相同。Cheng Yuling等［4］用兔抗鸡IgG和H6N1型AIV制备胶体金标物，以检测鸡抗AIV核蛋白与基质蛋白抗体作为检测线，研制出检测所有亚型AIV抗体的胶体金试纸条，使用该试纸条和血凝抑制实验检测326份样品，试纸条检测结果与血凝抑制结果不存在显著差异（P＜0.001），灵敏度和特异性分别为95.2%和94.3%。

在AIV病原检测方面，Yoshimi Tsuda等［5］以两株AIV H5亚型血凝素单克隆抗体制备了检测H5亚型AIV的胶体金试纸条，该试纸条检测灵敏度可达103.5～105.5EID50；使用该试纸条检测H5N1 AIV感染鸡，感染后48小时气管拭子检测呈阳性。彭伏虎等［6］用AIV H9亚型血凝素单克隆抗体和鸡抗AIV IgG分别作为标记物和检测线，制备了检测H9型亚AIV胶体金试纸条，该试纸条可检测到0.25血凝单位的病毒，较血凝实验灵敏度提高4倍；使用该试纸条和病毒分离方法检测157份泄殖腔和气管拭子样品，该试纸条检测出26份H9阳性样品，与病毒分离实验一致。徐一鸣等［7］以AIV H3和H7型血凝素蛋白单克隆抗体与马抗H3和H7型AIV多克隆抗体分别作为待标记物和检测线，制备了可同时检测H3和H7型AIV胶体金检测试纸条，灵敏度与血凝实验相当。

2.2 新城疫

新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的，长期以来对禽养殖业造成重大危害。在NDV抗体检测方面，李希友等［8］用胶体金标记新城疫病毒，制作了检测NDV抗体的免疫胶体金试纸条，使用IDEXX公司标准NDV阴性和阳性血清测定，该试纸条检测血凝抑制抗体最低滴度为41og2；使用该试纸条和血凝抑制方法同时检测60份样品，试纸条检测结果与血凝抑制试验法检测结果符合率为93.8%。

在NDV检测方面，高玲美等［9］以鸡抗NDV抗体制备金标抗体，兔抗鸡IgG作为检测线，研制出检测NDV的胶体金试纸条，用该试纸条和病毒分离法共同检测已知血清和临床样品共计100份，试纸条阳性检出率为94%，病毒分离法阳性检出率为96%，两者符合度为93%，表明该试纸条与病毒分离结果有较高的符合度。2009年李蓓蓓等［10］以两株NDV单克隆抗体作为免疫标记物和检测线，制备了检测NDV的胶体金试纸条，灵敏度比HA试验结果提高8倍。

2.3 传染性法氏囊病

传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的，主要感染幼鸡的急性高度接触性传染病。在IBDV抗体检测方面，2011年Isa Nurulfiza等［11］以鸡抗IBDV血清和灭活IBDV作为待标记物和检测线，研制出检测IBDV抗体的胶体金试纸条，使用该试纸条和BioCheck公司ELISA试剂盒检测已知阳性样品时，该试纸条检测准确度与商品化ELISA试剂盒相同，灵敏度高于商品化ELISA试剂盒，最短仅2分钟即出结果。

在IBDV检测方面，张改平等［12］以IBDV单克隆抗体制备胶体金标记物，研制出IBDV检测胶体金试纸条。该试纸条检测灵敏度高，实验条件下以强毒感染鸡36 h后，检测结果呈阳性。用该试纸条、琼扩实验和ELISA平行检测40份阳性样品，结果显示该试纸条灵敏度与ELISA相当，比琼扩试验提高了32～64倍；用上述三种方法检测238份临床样品和289份阳性样品，该试纸条与琼扩试验、ELISA检测灵敏度相同，阳性符合率为100%。

2.4 鸡传染性支气管炎

鸡传染性支气管炎是由鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus， IBV）引起的鸡的一种呼吸道传染性疾病，在我国鸡群中广泛存在。Zhang Jinliang等［13］用鼠抗鸡IgG单克隆抗体和大肠杆菌表达IBV核衣壳蛋白分别制备了胶体金标记物和检测线，研发出检测IBV抗体的胶体金试纸条。同时使用该试纸条、血凝抑制实验和IDEXX公司商品化ELISA试剂盒检测120份血清样品。结果显示，与血凝抑制实验相比该试纸条检测敏感性为92.11%，阳性符合率为85%；与商品化ELISA试剂盒相比该试纸条检测敏感性为92.31%，阳性符合率为95%。

2.5 禽白血病

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的肿瘤性疾病。Qian Kun等［14］以两株ALV衣壳蛋白单抗研发出检测ALV的胶体金试纸条。该试纸最低可以检测出600 pg重组病毒衣壳蛋白或70个TCID50的病毒；用该试纸条与IDEXX公司ELISA试剂盒检测361份泄殖腔拭子、76份1日龄雏鸡胎粪和663份分离毒株等3种样品（共1 100份），与ELISA试剂盒相比，该试纸条检测3种样品的符合率分别为93.91%、93.42%、100%，灵敏性分别为93.44%、94.12%、100%，特异性分别为94.00%、93.22%、100%；使用该试纸条、IDEXX公司ELISA试剂盒和PCR法共同检测20份疑似阳性样品，结果显示ICS与商品化ELISA试剂盒检测结果一致（19份呈阳性），与PCR方法符合率为95%（PCR检测结果为20份阳性）。

2.6 其它禽病

王爱华等［15］制备了检测减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus，EDSV）的胶体金试纸。该试纸条能检出浓度为1.35 µg/mL的EDSV。用该试纸条和血凝实验（HA）平行检测135份疑似阳性样品，ICS检测阳性率为52.6%，HA检测阳性率为58.5%，与HA相比，ICS检测阳性符合率为89.9%。

Shen Chanjuan等［16］制备了检测鸭瘟病毒抗体的胶体金试纸条。使用该试纸条、高特异性ELISA试剂盒与中和实验平行检测110份临床血清样品。结果显示，与ELISA试剂盒相比，ICS阳性符合率为85.37%，阴性符合率为82.61%；与中和实验相比，ICS阳性符合率为19.51%，阴性符合率为75.36%；统计分析显示，该试纸条检测灵敏性与ELISA试剂盒无显著差异，并显著高于中和实验。

陈素娟等［17］制备了检测鸭里默杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）的胶体金试纸条。该试纸条可检测到1、2、3、11型RA，最低可检测到6×103CFU的RA。使用该试纸条与细菌分离法检测疑似阳性样品，结果显示该试纸条检测灵敏度高于细菌分离实验，病料中RA的检出率为100%，与细菌分离实验相比阳性符合率为88.9%。

3　展望

3.1 提升检测灵敏度

与分子检测技术相比，部分胶体金免疫层析试纸条存在着检测灵敏度低、假阴性结果等缺陷。胶体金银扩增免疫层析技术是基于摄影技术的免疫层析方法，结合有抗体的胶体金颗粒会使银离子浓缩还原形成银原子，并在胶体金金微粒周围形成直径为5～10 µm的银簇，使标记物的体积增加到胶体金微粒直径的100倍，从而使检测能力大大提高。Mitamura K等［18］运用胶体金银扩增免疫层析技术制备了检测H5N1亚型禽流感病毒的试纸条，与普通的胶体金试纸条相比，其检测灵敏度提高了500倍。

3.2 区分野生型毒（菌）株与疫苗毒（菌）株

疫苗作为动物疫病防控的重要手段得到了广泛的应用，但疫苗的使用往往会干扰动物疫病诊断和监测。研制胶体金免疫层析试纸条时，可选用能区分野生型毒（菌）株与疫苗毒（菌）株的单克隆抗体或蛋白，从而获得能区分野毒（菌）株与疫苗毒（菌）株的胶体金试纸条。郭佃磊等［19］选用一株能特异性识别伪狂犬病野生型毒株的单克隆抗体，制备了检测野生型伪狂犬病病毒抗体的试纸条，使用该试纸条和IDEXX公司ELISA试剂盒平行检测样品，统计发现该试纸条与商品化ELISA试剂盒检测结果相符。

3.3 同一试纸条进行多疾病检测

疾病种类繁杂，并且许多疾病临床症状相似，出现混合感染。将易发生混合感染或常见的多种抗体或病原胶体金检测方法整合到同一胶体金试纸条中，可有效扩大试纸条检测范围，提高检测效率。Li Jinfeng等［20］制备了可同时检测禽流感病毒和新城疫病毒的胶体金银扩增免疫层析试纸条。该试纸条可同时检测AIV和NDV病毒，且检测灵敏度较商品化胶体金试纸条提高了100倍。

3.4 实现抗原或抗体定量检测

目前，大部分胶体金仅能做定性判断。而定量胶体金检测多根据胶体金试纸条检测已知不同浓度标准物时检测线存在的色差，来绘制标准物浓度与检测线颜色关系的标准曲线。当检测样品时，反应完成后将试纸条检测线颜色与标准曲线做比较，以确定待检样品中目的检测物含量。

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（责任编辑：杜宪）

The Application and Expectation of Using Immunochromatographic Strip in Detection of Avian Diseases

Qin Lide，Nan Wenlong，Chen Yiping
（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Immunochromatographic strip（ICS），with high specificity，convenience and conspicuous resultsis，is extensively applied in grassroots level and on-site testing. Various kinds of ICS have been developed and used in detection antigen or antibody of certain avian disease. The principle research advance and expectation of ICS were discussed in this paper.

ICS；avian disease；research advance；expectation

中文分类号：S851.34A

1005-944X（2016）08-0078-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.022

种禽场疾病综合防控与净化技术体系评估、论证和推广研究（2016YFD0501609）