重组酶聚合酶扩增技术在疾病快速检测中的研究进展

樊晓旭，赵永刚，李　林，吴晓东，王志亮（中国动物卫生与流行病学中心，外来病研究中心，山东青岛　266032）

重组酶聚合酶扩增技术在疾病快速检测中的研究进展

樊晓旭，赵永刚，李林，吴晓东，王志亮
（中国动物卫生与流行病学中心，外来病研究中心，山东青岛266032）

重组酶聚合酶扩增技术（RPA）是近年来开发的核酸扩增技术，在保证灵敏、特异的同时，操作简单、耗时短，能够在常温下10～20分钟内对靶DNA进行扩增，对实验设备、资源的要求低，适用于兽医、食品安全、生物防御、农业等领域的快速诊断。本文介绍了该技术的原理及目前在病毒、细菌、寄生虫等病原检测方面的应用，展望了其现场检测方面的应用前景。

重组酶聚合酶扩增；快速诊断；应用

1　引言

1985年，美国PE-Cetus公司发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应（PCR）。该原理类似于DNA的体内复制，反应通过变性、退火、延伸三个步骤，在基于靶序列两端互补的特异性寡核苷酸引物参与下，实现DNA的体外合成和扩增。现在，由英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），对核酸扩增技术进行改进［1］。相比经典PCR技术，RPA技术主要优势之一在于等温。常规PCR必须经过不同温度环节，而RPA反应在常温下即可进行反应，甚至人体体温即可提供反应所需的温度环境，其最适温度在37～42 ℃。优势之二在于检测耗时短。整个过程在10～20分钟内即可完成，且无需变性，不仅大大缩短了检测反应时间，也无需与PCR仪类似的专门温控设备，从而实现了便携式快速核酸检测。优势之三在于灵敏。RPA技术在缩短反应时间的同时也保持了高灵敏性，从单个模板分子可得到大约1012数量级的扩增产物。优势之四在于结果读取多样化。RPA结果可通过琼脂糖凝胶电泳检测，也可类似real-time PCR对扩增过程进行实时监控，还可以通过试纸条（侧流层析试纸条LFD）读取结果。本文拟从RPA技术的原理、在疾病快速检测中的应用方面作一综述。

2　原理

2.1 扩增原理

RPA反应中，重组酶首先与上下游引物结合，寻找同源的双链DNA，一旦定位，发生链交换，单链绑定蛋白（SSB）与亲本链绑定，阻止其与脱离的模板链发生相互作用。接着，DNA聚合酶从上下游引物的3'端启动模板合成，形成两条双链DNA，如此循环重复进而实现扩增［2］（图1）。若引入逆转录酶，建立RT-RPA方法，也适用于RNA的快速检测。

图1　重组酶聚合酶扩增反应机理［2］

2.2 引物、探针设计

在引物设计上，RPA与PCR类似，但差异之处在于引物的长度、序列组成和选取标准。RPA引物在长度上通常至少为30～35 bp，这是由于单链绑定蛋白需要寡核苷酸长度在30～35 bp以上才能将其整合到双链DNA［3］。所扩增的产物长度通常在500 bp以内，以100～200 bp为宜，可保证检测的敏感性和反应速度。此外，RPA引物的序列组成有着特定的要求：5'端3～5个核苷酸应当避免出现多个G；在3'端应有GC；避免连续出现多个相同核苷酸；GC含量占30～70%；避免引物形成二聚体和二级结构。3'端错配数超过一个碱基，会阻碍RPA反应的进行。在引物两端和中心有3个碱基发生错配，则会影响RPA的检测效率。RPA实验中的探针长度约为46～52个核苷酸，在3'端设计阻断物，如C3-间隔、磷酸盐、胺、生物素四乙二醇（BTG）等，抑制DNA链的延伸。探针内部添加了切割位点，可供exo、nfo、fpg酶切割。只有当探针与模板DNA呈绑定状态，才发生切割。探针的切割位点距离5'端至少30个碱基，距离3'端至少15个碱基。

2.3 扩增产物的检测方式

目前，TwistAmp basic kit试剂盒可采用琼脂糖凝胶电泳方法读取结果；TwistAmp exo/fpg kit 和TwistAmp nfo kit可分别通过实时荧光定量和侧流层析试纸条方式读取结果，上述两类试剂盒与TwistAmp basic kit相比，实际应用更为广泛。

在实时荧光定量检测中，TwistAmp exo探针内部切割位点侧面有dT-荧光发光基团，与dT-淬灭基团相对应。探针上具有四氢呋喃（THF）残基，可供大肠杆菌核酸外切酶III（exo酶）识别，切割分离荧光基团和淬灭基团，产生并积累荧光信号，供便携式荧光检测仪进行检测。同时，通过exo识别THF，释放3'端阻断物，在Bsu聚合酶作用下开始从3'端延长扩增。

在TwistAmp nfo实验中，探针上的四氢呋喃（THF）残基由大肠杆菌核酸内切酶IV（nfo酶）识别，抗荧光标记的金纳米颗粒与荧光团结合；通过绑定链霉亲和素，还可检测到在下游引物5'端标记的生物素，由此可通过侧流层析试纸条检测到标记的双链（图2）。

图2　重组酶聚合酶扩增不同的检测方法［2］

3　应用

以PubMed（NLM）数据库为例，按关键词“Recombinase Polymerase Amplification”进行题目检索，可检索到相关文献共63篇。其中，2010年1篇、2011年1篇、2012年3篇、2013年6篇、2014年19篇、2015年21篇，2016年截至5月11篇。从2010—2016年平均每月发表的文章数量可以看出，总体上，RPA相关研究数呈上升趋势（图3）。研究包括了对感染动植物的病原微生物检测，如病毒、细菌、寄生虫、钩端螺旋体、衣原体等。

图3　RPA相关文献发表情况（截至2016年5月）

3.1 病毒检测

在病毒检测方面，RPA被应用到婴儿艾滋病毒感染的检测中，无需复杂的仪器，在20分钟内即可检测低拷贝量的HIV-1亚型前DNA，同时增加了逆转录（RT）RPA反应，可检测HIV-1 RNA，方法敏感、快速、操作简便［4］。在31～43℃温度范围内，可保证RPA-HIV技术的检测效果，适于撒哈拉以南非洲地区户外使用。Yehia 等针对埃及禽流感病毒流行株，在H5基因HA2片段970 bp，设计了三条上游引物、三条下游引物、一条exo探针。开发H5RT-RPA方法可在7分钟检测到单个RNA分子，而实时RT-PCR检测方法耗时至少90分钟，实时RT-LAMP技术也需要30～60分钟。在保证敏感性和特异性的同时，RPA较其他检测方法缩短了反应时间［5］。针对犬细小病毒2型（CPV-2）VP2基因保守区片段（约210 bp）开发了RPA检测方法，反应可在等温水浴中进行，在资源有限的环境下可作为犬细小病毒检测潜在的替代方法［6］。针对4个血清型DENV 3'UTR保守区，设计的引物和探针，建立RT-RPA方法，相比RT-LAMP、RT-qPCR，RT-RPA表现出良好的一致性，是目前最快速的分子诊断方法，也成为实验室常规血清学检测方法的补充。Faye等［7］报道了在几内亚埃博拉疫情暴发期间，使用Qiagen公司SpeedXtract （SE）快速提取血清和拭子样本中的病毒RNA，并使用RT-RPA方法对N基因进行检测，其特异性、灵敏性良好，可在8分钟检测到血浆样品中15个拷贝数的RNA，在检测临床样本中，与RT-qPCR方法的复合率为100%。口蹄疫病毒实时定量RTRPA检测方法与RT-LAMP方法相比，引物设计上更为简单；较RT-PCR方法，节约了反应时间，适于边境口岸监测及口蹄疫暴发地区的感染动物筛查。目前，分别针对中东呼吸综合征冠状病毒、牛冠状病毒、牛痘病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、西格玛病毒、羊口疮病毒等设计了特异引物和探针，建立了RPA方法，证实具有良好的特异性和敏感性（表1）。

3.2 细菌检测

在细菌检测方面，关于RPA最早报道是对耐药性金黄色葡萄球菌的检测研究。Lutz等［8］开发了基于铂片微流体技术的卡盒，检出限为20个拷贝数DNA，反应15分钟即可得到结果。Ren等［9］针对布氏杆菌omp31基因片段设计了四条上游引物和四条下游引物，进行组合并检测其反应时间和荧光强度，筛选出最佳引物组合。通过将RPA技术与固相芯片技术结合，开发了淋病奈瑟氏菌、沙门氏菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的快速、多重检测技术。针对新生儿B族链球菌、结核分枝杆菌复合体（MTC）、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、弗朗西斯土拉杆菌等开发的RPA检测方法较PCR技术明显缩短了检测时间，具有临床分子诊断应用前景［10］。在食品安全检测领域，特别是在污染细菌的牛奶检测中，RPA酶和缓冲液混合，在39 ℃下，无需提取DNA，即可检测牛奶样品中的沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、副溶血性弧菌，整个检测至结果读取总耗时仅为30分钟。

表1　RPA技术检测病原的报道

3.3 寄生虫检测

在寄生虫检测方面，Crannell等［11］采用RPA检测粪便样品中贾第鞭毛虫，使用侧流层析试纸条读取结果，每毫升粪便样品中最低可检测到103～103.5个卵囊，敏感性是PCR方法的73%，特异性是显微镜检查方法的95%，方法通过进一步改进有望用于“point-of-care”（POC，床旁检测、现场检测）。Crannell等［12］进一步开发了基于RPA技术的多重侧流层析试纸条，通过构建不同的标记探针，能够同时检测和鉴别引起腹泻的原虫：贾第鞭毛虫、隐孢子虫和阿米巴虫DNA，从粪便样本提取活寄生虫DNA，检测限分别为每个反应444、6、9个寄生虫。目前还开发尿路血吸虫、阿米巴变形虫、恶性疟原虫侧流层析试纸条，已证实具有良好的特异性和灵敏性，且使用便捷。

3.4 其他病原

针对山羊支原体、恙虫病立克次体、沙眼衣原体（O. tsutsugamushi或 R. typhi）分别开发了荧光定量RPA方法和RPA侧流层析试纸条，检测灵敏度与荧光定量PCR方法相当。Ahmed等［13］开发实时定量RPA方法用于检测血液临床样品中的钩端螺旋体，并有望检测水库等环境中存在的病原。

4　展望

今后RPA检测技术有望向多重、现场快速检测方向发展。

4.1 多重

使用绝缘硅芯片制备64道光学环状谐振器，与RPA技术联用，可实现样品的多重检测。Crannell等［12］基于RPA技术的多重侧流层析试纸条，通过构建不同的标记探针，能够同时检测和鉴别引起腹泻的原虫：贾第鞭毛虫、隐孢子虫和阿米巴虫。通过将RPA技术与固相芯片技术结合，开发了多重检测技术，通过特定的固定化寡核苷酸产生空间分辨的信号，并对信号进行读取，实现在38℃下对淋病奈瑟氏菌、沙门氏菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的快速检测［14］。

4.2 现场

由于实时定量RT-PCR仪通常体积较大、价格昂贵、操作复杂，不适合现场筛查检测分析。目前基于RPA技术和SlipChip（滑动芯片），开发透明丙烯酸树脂装置，用于检测艰难梭菌毒素B基因，由于其易用性和低成本，可投放于医疗条件有限的地区应用于现场快速诊断［1］。微流体数字化RPA滑动芯片，可对单分子靶核酸进行放大和计数，从RPA扩增反应起始前可淘汰假阳性结果，采用终点荧光读数进行“是”或“否”的数字量化［15］。例如，2014年，当几内亚暴发埃博拉疫情时，使用了移动实验室对埃博拉病毒进行诊断，其核心技术为RPA。移动实验室包括手套式操作箱和DiaS装置（含用于实时荧光检测的ESEQuant TS2和集成触摸屏），易于安装和运输。通过使用DiaS装置，进行RT-RPA反应，包括加样和混匀时间，共需20分钟即可读取结果。移动实验室通过太阳能电池可工作16小时［7］。

5　小结

相比传统血清学检测，RPA技术的优势在于可实现感染早期的诊断，且敏感性高。与RPA等温扩增技术类似，迄今，由日本Eiken公司开发的LAMP（环介导等温扩增）技术的相关文献报道已超过1 000篇。但相比RPA技术，LAMP技术引物设计繁琐、反应时间长、读取结果主观性强。RPA方法操作简单，耗时短，无需昂贵的设备及相关的专业培训，在检测的灵敏性和特异性上与荧光定量PCR相当。该方法适用于一些难以根除的疾病，如艾滋病、疟疾、肺结核以及烈性、新发传染病病原，如埃博拉病毒、中东呼吸综合征冠状病毒、寨卡病毒的检测，特别适用于经济欠发达地区的现场检测，具有广阔的应用前景。

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（责任编辑：杜宪）

Research Progress of Recombinant Enzyme Polymerase Amplification （RPA）in Rapid Detection of Diseases

Fan Xiaoxu，Zhao Yonggang，Li Lin，Wu Xiaodong，Wang Zhiliang
（China Animal Health and Epidemiology Center，External Disease Research Center，Qingdao，Shandong 266032）

Recombinase polymerase amplification （RPA） is a nucleic acid amplification technique developed in recent years. The test retains the highest levels of sensitivity and specificity，while adding extraordinary speed and portability. The assay generally amplified target DNA at room temperature in 10～20 minutes. It reduces the need of infrastructure and resources and is particularly suitable for rapid diagnosis in veterinary，food safety，biological defense，agriculture and other fields. The principle of RPA as well as the current application in the detection of viruses，bacteria，parasites and other pathogens were introduced，and the future use of testing in point of care and field settings were prospected.

recombinase polymerase amplification；rapid diagnosis；application

R730.43

A

1005-944X（2016）08-0072-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.08.021

潜在入侵的畜禽疫病口岸监测技术研究（2016YFD0501104）

王志亮