RUNX3 甲基化在非肌层浸润性膀胱癌患者中的表达

岳 峰* 韩 伟 赵 晨 江 彬

（大连市友谊医院泌尿外科，辽宁 大连 116001）

RUNX3 甲基化在非肌层浸润性膀胱癌患者中的表达

岳 峰* 韩 伟 赵 晨 江 彬

（大连市友谊医院泌尿外科，辽宁 大连 116001）

目的 对非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）患者的癌旁正常尿路上皮组织进行RUNX3甲基化表达的检测，证实RUNX3在膀胱癌发生发展过程中的作用。方法 接受经尿道电切术的膀胱肿瘤患者65例，取肿瘤组织和对应癌旁正常尿路上皮组织进行试验。采用甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）的方法对RUNX3甲基化程度进行检测。结果 非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）患者的肿瘤标本中RUNX3甲基化发生率明显高于癌旁正常尿路上皮组织（P=0.03），癌旁正常尿路上皮组织和肿瘤组织中RUNX3甲基化率分别为47%和69%，癌旁正常尿路上皮组织中RUNX3甲基化率与肿瘤数量（P=0.021）和疾病进展（P=0.036）相关。多因素Cox回顾分析提示RUNX3在正常黏膜中出现甲基化是肿瘤进展的独立因素。结论 RUNX3甲基化与正常尿路上皮向膀胱癌转化相关。RUNX3甲基化在癌旁正常尿路上皮中的表达可以为接受经尿道电切手术的非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）患者的肿瘤进展起到预测作用。

膀胱癌；甲基化；非肌层浸润性

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病率居泌尿系统恶性肿瘤的首位。约85%的膀胱癌为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC），NMIBC大部分具有惰性和复发性的特点，少部分还可以进展为肌层浸润性膀胱癌（MIBC），具有侵袭性［1］。当NMIBC行经尿道手术（TUR），癌旁正常尿路上皮组织日后进展为癌的可能性为50%～80%。所以，对NMIBC患者进行疾病进展的预测对医师和患者都十分必要。建立一种既准确又可靠的诊断指标更是十分的必要。

RUNX3不仅是癌症的肿瘤抑制因子，还是TGF-β家族信号通路的靶点。非活性的RUNX3被甲基化后引起膀胱癌发生，是膀胱癌的一个十分重要的预测因子，本实验RUNX3在40例正常对照组膀胱上皮组织中全部表达阴性。本文着重对RUNX3甲基化在NMIBC患者癌旁正常尿路上皮的表达来帮助对有潜在肿瘤复发和进展风险的患者进行分类，进行早期干预。

1　材料与方法

1.1一般资料：收集我院65例NMIBC肿瘤标本和对应正常癌旁上皮组织。男47例，女18例，年龄60.5岁（51～84岁）。肿瘤分级采用2002TNM分类和1973WHO分级系统。

1.2基因组DNA提取和甲基化特异性聚合酶联反应（MS-PCR）：使用基因组DNA纯化系统进行标准DNA提取（Promega，Madison，WI，USA），无水乙醇沉淀纯化，保存于-20 ℃冰箱中。基因组DNA的重亚硝酸盐处理使用的是EZ DNA Methylation-Gold Kit（Zymo Research，Orange，CA，USA）标准方法。

1.3数据分析：对初发NMIBC患者的病理和预后特征进行分析研究，根据癌旁正常尿路上皮组织中甲基化水平进行分层分析。分类变量使用卡方检验进行比较和Kaplan-Meier方法计算进展时间。计算差别使用log轶统计量。邻近正常尿路上皮行RUNX3甲基化后对预后的评估使用Cox相对危险回归法。统计分析使用SPSS 12.0软件，对数据进行t或卡方检验，α=0.05作为数据的检验水准，P＜0.05有统计学意义。

2　结 果

中位随访时间58个月（14～79个月），术后接受膀胱内灌注治疗53/65，随访期内，37/65患者出现复发，18/65出现疾病进展。47/65表现为肿瘤RUNX3甲基化，35/65癌旁正常上皮组织RUNX3甲基化。

RUNX3甲基化在正常组织中的诊断价值：RUNX3甲基化在癌旁正常上皮组织表达与肿瘤数量（P=0.021）和肿瘤进展（P=0.036）相关，癌旁正常上皮RUNX3甲基化阳性患者具有显著的更短的无进展生存期（P=0.017）。然而，Kaplan-Meier检验提示两组复发情况无显著差别（P=0.895）。双重甲基化的患者（即肿瘤和癌旁组织均检测出RUNX3甲基化）比单甲基化和无甲基化有更短的无进展生存期（P=0.036）。多因素分析提示，肿瘤分级（P=0.042）和癌旁正常组织RUNX3甲基化（P=0.045）是NMIBC的独立进展因素。

3　讨 论

膀胱癌具有多灶发病、复发性高以及同时或异时发病的特点，肿瘤细胞的微侵入性特点给膀胱癌的临床诊断带来极大困难。有研究发现肿瘤的微侵入性特点是不同时间或位置，原发肿瘤通过黏膜下种植、转移进行的［2］。然而，正常外观的膀胱黏膜或病理证实正常的黏膜组织也可能有癌前改变，存在着肿瘤发生的不确定性。从Wolff等对膀胱癌采用高通量DNA甲基化检测，正常外观的膀胱组织和无癌膀胱组织均可有癌前改变。我们发现在癌旁正常组织中RUNX3甲基化率为47%，但仍低于肿瘤组织69%。因为尿路上皮癌是多灶性的恶性肿瘤，RUNX3甲基化与正常黏膜向膀胱癌转变相关，那么异常甲基化就是膀胱组织恶变前的反应。RUNX3甲基化可能参与了膀胱癌发生的早期事件。

肿瘤抑制基因沉默导致异常高的甲基化是人类癌症发病中最早，也是最普遍存在的事件之一。普遍来说，异常甲基化在瘤前期病灶中可以被检测出来，Dhawan等报道多种癌症中异常升高的甲基化率和疾病进展相关，包括肺癌和肝癌，发现从正常尿路上皮向尿路上皮癌转变过程中甲基化率是显著升高的［3-12］，并且最近一系列研究发现膀胱癌和RUNX3之间的相关性，但是目前RUNX3甲基化研究还没有关于膀胱癌正常癌旁组织的报道。膀胱癌行TUR术后的正常外观的尿路上皮RUNX3进行甲基化检测，或复查膀胱镜，是NMIBC患者肿瘤进展的可靠预测因子，也可以用来区分高进展风险的患者，对于低进展风险的患者也有降低复查频率的作用。

作为诊断预测因子，将患者分为双甲基化、单甲基化，和无甲基化组，双甲基化组具有更差的无进展生存期。足以说明正常RUNX3甲基化可以作为诊断预测因子。由于NMIBC和MIBC在生物学行为和预后不同，所以分开进行研究是有必要的。本实验主要遗憾为实验病例数较少。进一步需要研究的内容较多，生物多样性例如mRNA表达或蛋白水平研究仍需进行。我们正在收集更多的样本，进行膀胱癌患者尿液的脱落细胞RUNX3甲基化检测。

最后，由于RUNX3异常甲基化频繁出现在正常癌旁尿路上皮中，将来在膀胱癌的诊断、治疗、复查方面，建议将RUNX3甲基化检测作为常规检测在高危人群中进行。

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R737.14

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1671-8194（2016）27-0019-02

大连市卫生局局级课题

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