表没食子儿茶素没食子酸酯对2型糖尿病大鼠主动脉Ⅰ、Ⅳ型胶原及纤维连接蛋白表达的影响

侯改霞　赵功炎　习雪峰　肖国强

(河南大学体育学院，河南　开封　475001)



表没食子儿茶素没食子酸酯对2型糖尿病大鼠主动脉Ⅰ、Ⅳ型胶原及纤维连接蛋白表达的影响

侯改霞赵功炎习雪峰肖国强1

(河南大学体育学院，河南开封475001)

〔摘要〕目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对2型糖尿病大鼠主动脉Ⅰ、Ⅳ型胶原(Col Ⅰ、Col Ⅳ)、纤维连接蛋白(FN)表达的影响及可能机制。方法通过高脂喂养加腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)构建2型糖尿病大鼠模型。雄性SD大鼠分为正常对照组8只，模型组、EGCG低、中、高剂量组，每组10只。EGCG给药组大鼠每周灌胃7 d。实验结束后检测大鼠血液血糖(GLU)、糖化血红蛋白(GHb)、糖化血清蛋白(GSP)和主动脉超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、Col Ⅰ、Col Ⅳ、FN水平的变化。结果与正常对照组相比，糖尿病模型组的血液GLU、GHb、GSP水平和主动脉氧化应激水平及主动脉Col Ⅰ、Col Ⅳ、FN表达均显著升高(P<0.01)；与模型组相比，EGCG中、高剂量组血液GLU、GHb、GSP水平和主动脉氧化应激水平及主动脉Col Ⅰ表达均显著降低(P<0.05)，EGCG高剂量组主动脉Col Ⅳ、FN表达显著降低(P<0.05)。结论EGCG对2型糖尿病大鼠主动脉胶原合成异常增加具有明显的改善作用，机制可能与EGCG的降血糖、抗氧化及降低氧化应激下游与胶原代谢相关的信号通路效应有关。

〔关键词〕2型糖尿病；表没食子儿茶素没食子酸酯；主动脉；胶原代谢

1华南师范大学体育科学学院

第一作者：侯改霞(1978-)，女，副教授，博士，主要从事运动、药物与慢性病防治研究。

糖尿病大血管病变的特点是血管平滑肌细胞和胶原纤维随着病程进行性增加，血管壁胶原纤维增加可导致血管硬度增加，表现为血管收缩、舒张功能障碍〔1〕，是导致糖尿病心血管疾病致死致残的重要原因之一。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是儿茶素中研究最多的生物活性物质，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、防辐射和调节糖脂代谢等多种生物学活性，对肥胖、糖尿病、癌症、心血管和神经系统等疾病具有改善作用。已有研究表明EGCG可以降低糖尿病大鼠肾脏胶原异常增生，可有效改善糖尿病大鼠肾脏纤维化〔2〕。但EGCG对糖尿病动物主动脉胶原代谢影响的研究却很少见。本文分析EGCG对糖尿病大鼠主动脉Ⅰ、Ⅳ型胶原(Col Ⅰ、Col Ⅳ)、纤维连接蛋白(FN)代谢的影响及其作用机制。

1材料与方法

1.1动物造模与分组雄性SD大鼠普通饲料适应性喂养1 w后，随机分成：正常对照组(8只)和高脂饮食组(43只)，正常对照组继续饲喂普通饲料，高脂饮食组改为高脂饲料喂养。饲喂6 w后，高脂饮食组大鼠过夜空腹12 h，腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)。注射72 h后检测大鼠随机血糖浓度，随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠暂时成模标准。剔除血糖不达标大鼠。1 w后复查暂时成模大鼠，随机血糖仍≥16.7 mmol/L为建模成功，剔除不达标大鼠。共有40只大鼠造模成功。将造模成功后大鼠分为模型组、EGCG低、中、高剂量组，每组10只。

1.2主要试剂STZ购自Sigma公司，Col Ⅰ、Col Ⅳ、FN一抗、二抗和DAB显色试剂购自北京博奥森生物科技有限公司，血糖(GLU)、糖化血红蛋白(GHb)、糖化血清蛋白(GSP)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量检测试剂盒购自南京建成生物研究所。

1.3EGCG灌胃处理EGCG溶于双蒸水中制成(12 mg/ml)悬浊液。EGCG低(25 mg·kg-1·d-1)、中(50 mg·kg-1·d-1)、高(100 mg·kg-1·d-1)剂量组大鼠分别采用灌胃给药方式，给药组大鼠每周灌胃7 d，其他组大鼠灌胃双蒸水，共12 w。

1.4动物取材和指标检测给药第12周末，各组大鼠过夜禁食12 h后，将大鼠称重后腹腔麻醉，剖腹，从腹主动脉取血，一部分全血用于GHb检测，其余全血3 000 r/min离心20 min，取血清置于-80℃冰箱保存检测GLU、GSP。取胸主动脉置于4%多聚甲醛中固定以备免疫组化检测，另取腹主动脉置于 -80℃冰箱保存以做MDA、SOD含量检测。

1.4.1血液GLU、GHb、GSP水平检测GLU测试采用磷钼酸法，GHb采用比色法，GSP采用果糖胺法。操作检测流程严格按试剂盒说明书进行。

1.4.2主动脉MDA含量和SOD活性检测MDA采用硫代巴比妥酸法，SOD采用分光光度法，操作检测流程严格按试剂盒说明书进行。

1.4.3主动脉Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN免疫组化检测常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片，片厚4 μm，SABC法免疫组化染色，DAB显色，中性树脂封片。阳性部位显色为棕黄色，每张切片随机选出5个视野，在400倍光镜视野下获取图像，采用Image-Pro Plus Version 6.0图像分析系统分析，得出每个视野的平均光密度值(IOD/area)。

2结果

2.1EGCG对糖尿病大鼠血液GLU、GHb和GSP的影响与正常对照组相比，模型组、EGCG低、中、高剂量组血液GLU、GHb、GSP水平均显著升高(P<0.01)；EGCG中、高剂量组血液GLU、GHb、GSP水平均显著低于模型组(P<0.05)。见表1。

2.2EGCG对糖尿病大鼠主动脉MDA含量和SOD活性的影响与正常对照组相比，模型组、EGCG低、中、高剂量组主动脉MDA含量均显著升高(P<0.05，P<0.01)，SOD活性显著降低(P<0.05)；EGCG中、高剂量组主动脉MDA含量均显著低于模型组(P<0.05)，SOD活性显著高于模型组(P<0.01)。见表2。

2.3EGCG对糖尿病大鼠主动脉Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表达的影响与正常对照组相比，模型组主动脉Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表达均显著升高(P<0.01)；EGCG中、高剂量组主动脉Col Ⅰ表达虽显著低于模型组(P<0.05)，但仍高于正常对照组(P<0.05)；EGCG高剂量组主动脉Col Ⅳ、FN表达均显著低于模型组(P<0.05)。见表2，图1。

表1　EGCG对糖尿病大鼠血液GLU、GHb和

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01

表2　EGCG对糖尿病大鼠主动脉MDA含量、SOD活性、Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表达的影响

与正常对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

图1　EGCG对2型糖尿病大鼠主动脉Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表达的影响(DAB，×400)

3讨论

本实验结果表明，糖尿病模型组大鼠空腹GLU、GHb和GSP均明显升高。GHb是血液中血红蛋白与糖类经过缓慢、连续的非酶促反应生成的产物，合成速率与红细胞所处环境中的糖浓度成正比，GHb能反映测定点之前1～2个月甚至更长时间内的平均血糖水平。GSP是一类类似果糖胺的物质，是血浆中蛋白质与葡萄糖非酶糖化过程中形成的一种高分子酮胺结构，其浓度与血糖水平呈正相关，并保持相对稳定，GSP反映的是测定前1～3 w内血糖的平均水平。因此GHb和GSP分别从长期和短期反映了机体血糖浓度变化，是临床糖尿病病人诊断和评估血糖水平的良好指标〔3〕。EGCG可显著降低2型糖尿病大鼠血液GLU、GHb和GSP水平，且以EGCG高剂量组的效果最好，提示EGCG可长期稳定的改善2型糖尿病大鼠糖代谢紊乱的现象，可能机制：① α-葡萄糖苷酶是小肠内单糖吸收入血的关键酶。EGCG具有α-葡萄糖苷酶抑制剂的作用，可降低餐后血糖的持续升高，发挥血糖调节作用〔4〕。② EGCG是胰岛素敏感因子〔5〕，可增加胰岛素敏感性〔6～8〕，改善胰岛素抵抗和糖代谢障碍，增加体内葡萄糖的吸收和代谢。③ EGCG通过其高效的抗氧化活性，有效地清除自由基，改善体内血糖升高引起的氧化应激反应，减少氧化应激对胰腺β细胞的损伤，从而避免了胰岛素分泌功能障碍而导致的血糖进一步升高〔9，10〕。④ 糖异生增强是糖尿病患者空腹血糖升高的主要原因之一。葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是糖异生过度活化的关键酶，肝细胞核因子4α(HNF4α)是PEPCK和G6Pase关键的转录因子，EGCG可通过下调肝脏〔11〕、肠道〔12〕HNF4α的表达而降低PEPCK和G6Pase的表达，抑制肝脏和肠道糖异生作用的过度活化。

葡萄糖自氧化、线粒体产生的活性氧(ROS)、非酶糖基化和多元醇通路是糖尿病机体内ROS的主要来源。同时高血糖还可使糖尿病机体组织内抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶基因表达下调，ROS清除减少〔13〕。动物和人体实验均证实高血糖所导致的氧化应激水平上升可导致胰岛素抵抗、抑制胰岛素分泌，进而诱导β细胞凋亡，并进一步升高机体血糖水平，是糖尿病及其并发症发生发展的重要原因之一〔14，15〕。

本实验表明，2型糖尿病大鼠主动脉氧化应激水平显著升高，而EGCG中剂量组和高剂量组对2型糖尿病大鼠主动脉氧化应激水平均有降低作用，尤其以EGCG高剂量组的效果最好，这可能与EGCG的降血糖作用有密切关系。但EGCG对2型糖尿病大鼠主动脉氧化应激水平降低作用的另一个重要原因是EGCG的强抗氧化作用。EGCG分子结构上的B环和D环上具有多个抗氧化作用的酚羟基结构，因此具有很强的抗氧化作用〔16〕。但EGCG抗氧化作用的详细机制尚不完全明确，推测与其清除自由基〔17〕、提高抗氧化酶活性〔18，19〕的作用有关。

糖尿病大血管病变是糖尿病患者心血管疾病的重要危险因素。由糖尿病所引起的血管壁胶原含量的增加与血管收缩、舒张功能障碍密切相关。

Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN是主动脉壁细胞外间质成分(ECM)的重要组成部分。本研究结果提示2型糖尿病大鼠主动脉壁胶原合成异常增加，而EGCG中剂量组和高剂量组对2型糖尿病大鼠主动脉胶原合成异常增加均具有改善作用，尤其以EGCG高剂量组的效果最好。分析原因可能与EGCG有效降低2型糖尿病大鼠血糖和主动脉氧化应激水平有关。机体在高血糖状态下，ROS产生增多，激活多条与ECM合成有关的信号通路，直接或间接促进致纤维化因子TGF-β1蛋白表达，促进ECM成分的合成〔20，21〕。2型糖尿病大鼠血糖和主动脉氧化应激水平的下降，主动脉壁胶原合成异常增加得到显著改善；ECM的降解主要与纤维蛋白溶酶原激活剂(PA)/PA抑制剂(PAI)和基质金属蛋白酶(MMP)/MMP抑制剂(TIMP)系统有关。有研究表明高血糖所导致的氧化应激水平增加可打乱糖尿病机体PA/PAI和MMP/TIMP的表达之间的协调关系，致使ECM降解减少〔22，23〕。2型糖尿病大鼠血糖和主动脉氧化应激水平的下降，主动脉壁胶原降解能力得到显著改善。

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〔2014-09-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

通讯作者：习雪峰(1978-)，男，博士，讲师，主要从事运动、药物与慢性病防治研究。

基金项目：河南省科技厅2011年科技发展计划项目(No.112102310576)

〔中图分类号〕R587

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6330-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.005