加味孔圣枕中丹对局灶性脑缺血模型大鼠神经细胞凋亡的影响

武　冰　吴智春　季旭明　刘国伟　刘　恒　于华芸

(山东中医药大学，山东　济南　250355)



加味孔圣枕中丹对局灶性脑缺血模型大鼠神经细胞凋亡的影响

武冰吴智春季旭明刘国伟刘恒1于华芸

(山东中医药大学，山东济南250355)

〔摘要〕目的研究加味孔圣枕中丹对局灶性脑缺血模型大鼠神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2、P53表达的影响。方法线栓法建立局灶性脑缺血大鼠模型，随机分为模型组、银杏叶组及加味孔圣枕中丹组，另设假手术组(n=10)。灌胃给药，连续14 d。观察大鼠神经功能症状评分，荧光TUNEL法检测神经细胞凋亡，免疫组织化学法测定Bcl-2、P53表达。结果与模型组比较，加味孔圣枕中丹能显著降低局灶性脑缺血大鼠Zea Longa 和网屏实验评分，降低神经细胞凋亡率和P53蛋白表达，增强Bcl-2蛋白表达(P均<0.05)。结论加味孔圣枕中丹能改善脑缺血引起的神经功能损伤，其机制可能与调控凋亡相关蛋白表达、抑制脑缺血引起的神经细胞凋亡相关。

〔关键词〕加味孔圣枕中丹；局灶性脑缺血；细胞凋亡；Bcl-2；P53

1山东大学齐鲁医院耳鼻喉实验室

第一作者：武冰(1991-)，女，在读硕士,主要从事中药资源与质量控制研究。

神经细胞凋亡是脑缺血疾病造成神经系统损伤的重要病理生理机制，通过相应措施延缓或抑制神经细胞凋亡，对于改善、恢复患者神经功能有积极作用。加味孔圣枕中丹可补肾活血开窍，具有改善脑缺血后神经功能损伤的作用〔1〕。本次研究采用局灶性脑缺血模型大鼠，通过观察加味孔圣枕中丹对脑缺血大鼠神经细胞凋亡的干预作用，探讨其改善神经功能损伤的可能机制。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物清洁级SD雄性大鼠，240～280 g，购自山东中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(鲁)20050015。

1.1.2实验药物加味孔圣枕中丹组成有龟板、石菖蒲、生龙骨、山茱萸、肉苁蓉、丹参、远志、川芎，饮片均购自山东省宏济堂大药店，水煎浓缩制成200%浓度(含生药2 g/ml)；华纳杏银杏叶分散片(批号：100603)，湖南华纳大药厂有限公司，实验前配制成混悬液，浓度为2.2 g/100 ml。4℃冰箱储存备用。

1.1.3实验试剂和仪器Bcl-2、P53单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；TUNEL试剂盒(美国ROCHEI公司)；LEICARASP300全自动脱水机(德国)；LEICARM2145自动切片机(德国)；奥林巴斯IX71荧光倒置显微镜(日本)。

1.2实验方法

1.2.1模型复制采用Longa等〔2〕报道的大脑中动脉栓塞 (MCAO)法建立局灶性脑缺血大鼠模型。模型成功判定标准：左侧肢体疼痛回缩迟钝或消失；提尾倒悬时左上肢向胸前屈曲；行走时左侧倾倒或向左转圈；右侧出现霍纳征，如霍纳征不出现则应有左侧肢体瘫痪体征。假手术组除插线1 cm外，其余步骤同造模组 。

1.2.2动物分组及给药30只MCAO大鼠随机分为模型组、银杏叶组和加味孔圣枕中丹组，另设假手术组，每组10只。造模成功24 h后分别予以银杏叶片混悬液和加味孔圣枕中丹水煎浓缩液(18 ml/kg体质量)灌胃，假手术组及模型组大鼠灌胃等容量生理盐水，1次/d，连续14 d。实验大鼠未到观察时相点死亡者，通过随机抽样原则补齐。

1.2.3动物神经行为学评价模型制作成功后分别在术后24 h、给药7 d和给药14 d进行神经功能评分，采用Zea Longa和网屏实验评分法〔2,3〕。

1.2.4荧光TUNEL法检测神经细胞凋亡组织切片常规脱蜡、水合，加蛋白酶K(20 μg/ml)，37℃孵育30 min，与含末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和TMR结合的脱氧尿苷三磷酸(TMR-dUTP)反应液在37℃下孵育60 min，PBS液洗3次。实验的阴性对照用去离子水代替TdT液。细胞核用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)复染。荧光显微镜下观察，细胞核呈蓝色荧光，凋亡细胞呈红色荧光。每例观察5个视野(×400)，计算细胞凋亡率(AR)。AR(%)=(TUNEL染色阳性细胞数/神经细胞总数)×100%。

1.2.5免疫组织化学法检测Bcl-2、P53蛋白表达组织切片常规脱蜡、抗原修复，按照试剂盒说明书操作，应用SABC法。200倍镜下，随机选取3个视野，Image Pro Plus医学图像分析系统进行图像分析，计算积分光密度(IOD)。

1.3统计学处理采用SPSS14.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1各组大鼠神经行为学比较与假手术组比较，模型组大鼠Zea Longa评分和网屏实验评分显著升高(P<0.05)；与模型组比较，加味孔圣枕中丹组大鼠Zea Longa评分和网屏实验评分显著降低(P<0.05)，见表1，表2。

2.2对神经细胞凋亡的影响TUNEL结果显示，假手术组神经细胞凋亡率为(18.46±1.96)%，模型组为(42.18±1.87)%，银杏叶组为(38.88±1.13)%，加味孔圣枕中丹组为(26.10±1.54)%。与假手术组比较，模型组神经细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与模型组比较，银杏叶组、加味孔圣枕中丹组大鼠神经细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图1。

2.3对凋亡相关蛋白Bcl-2和P53表达的影响免疫组化结果显示，Bcl-2阳性细胞可见棕黄色或棕褐色颗粒，阳性表达定位于神经细胞胞质、核膜及突起。Bcl-2蛋白各组阳性表达IOD值分别为假手术组(3 825.42±1 190.22)，模型组(2 793.89±326.41)，银杏叶组(3 554.68±807.70)，加味孔圣枕中丹组(3 677.07±762.96)。P53阳性表达定位在细胞核或细胞质，阳性细胞可见棕黄色或棕褐色颗粒。P53蛋白各组阳性表达IOD值分别为假手术组(2 189.78±578.13)，模型组(2 844.45±851.44)，银杏叶组(2 513.22±437.73)，加味孔圣枕中丹组(2 263.41±579.38)。与假手术组比较，模型组大鼠Bcl-2蛋白表达明显降低，P53蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组比较，银杏叶组大鼠Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组比较，加味孔圣中丹组大鼠Bcl-2蛋白表达显著升高，P53蛋白表达显著降低(P<0.05)。见图2，图3。

表1　大鼠Zea Longa评分结果

与假手术组比较:1)P<0.05；与模型组比较2)P<0.05

表2　大鼠网屏实验评分结果

与假手术组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05；与银杏叶组比较:3)P<0.05

图1　神经细胞凋亡(荧光TUNEL，×400)

图2　各组Bcl-2蛋白表达(SABC,×200)

图3　各组P53蛋白表达 (SABC,×200)

3讨论

80%左右的脑卒中属于缺血性脑卒中〔4,5〕。脑缺血后半暗区神经细胞处于低氧、低灌注状态，发生以细胞凋亡为主的迟发性死亡，是缺血后神经功能损伤的重要原因之一。保护神经细胞，抑制其凋亡可减少缺血后神经功能损伤，是防治脑缺血损伤的重要干预靶点。

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主性死亡过程，受促凋亡基因和抑凋亡基因的协同调控。bcl-2基因是最早发现的抑凋亡基因，编码Bcl-2家族蛋白质。Bcl-2蛋白可以在神经系统内表达，参与磷酸化依赖性调节，线粒体介导的细胞内凋亡途径。研究发现Bcl-2的表达与细胞存活密切相关，增加脑内Bcl-2的表达可减少脑梗塞灶大小，减少神经细胞的凋亡，引起特定脑区神经细胞数目的增多〔6，7〕。p53基因是促进细胞凋亡的重要基因，编码P53蛋白。P53蛋白可防止细胞增生和保持DNA受损基因组的完整性，以细胞凋亡的方式清除异常细胞，在多种脑缺血动物模型中P53表达上调〔8,9〕。

缺血性脑血管病属中医学“中风”范畴，肾精亏虚，瘀血阻窍是其主要病机〔10,11〕。“脑为髓之海”，赖髓之充养，脑髓为肾之精华所化生。缺血性脑血管病多发于中老年人，中年之后肾精渐亏，不能生髓充脑，髓海空虚，则脑的生理功能得不到正常发挥，此为病本。肾精不足，阴血亏虚，脉道失养，血行涩滞可留瘀；加之老年人喜静好卧，过于安逸，亦可使气血运行缓慢，甚则停而为瘀，脑络中血液凝涩不畅，则发为中风。可见本病以肾虚为本，瘀血阻窍为标。治当以补肾活血开窍以标本兼顾。筛选《备急千金要方》孔圣枕中丹加味，方中龟板、山茱萸、肉苁蓉滋肾阴、温肾阳，治肾精亏虚之本；川芎、丹参活血祛瘀，石菖蒲、远志、龙骨开窍醒神，五药活血开窍以治病标。方中补阴药与补阳药配伍，以阴阳并补；补肾与活血开窍药同用，以标本兼顾，尤为适宜于缺血性脑中风辨证为肾虚瘀阻窍闭者。 本次研究发现加味孔圣枕中丹能明显改善局灶性脑缺血引起的大鼠神经功能缺损，其作用机制可能与抑制神经细胞凋亡、上调大鼠脑组织Bcl-2蛋白表达、下调P53蛋白表达相关。

4参考文献

1于华芸,吴智春,赵艳,等.加味孔圣枕中丹对局灶性脑缺血大鼠神经行为学及VEGF表达的影响〔J〕.世界中西医结合杂志,2013；8(12):1211-4.

2Longa EZ ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats 〔J〕.Stroke,1989；20(1):84-91.

3徐莉,李玲,陈景藻,等.康复训练对大鼠脑梗塞神经功能恢复的影响〔J〕.中华物理医学与康复杂志,2000；22(2):86-8.

4陈竺.全国第三次死因回顾抽样调查报告〔M〕.北京：中国协和医科大学出版社，2008：14-7.

5Zhou MG,Offer A,Yang G,etal.Body mass index,blood pressure,and mortality from stroke:a nationally representative prospective study of 212,000 Chinese men〔J〕.Stroke,2008；39(3):753-9.

6Martinou JC,Youle RJ.Mitochondria in apoptosis:Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics 〔J〕.Dev Cell,2011；21(1):92-101.

7李伟,吴刚,薛荣亮.Bcl-2过度表达对全脑缺血再灌注后大鼠海马回P53蛋白表达的影响〔J〕.吉林大学学报(医学版),2012；38(2):175-9.

8周桔,罗荣保,汤长发,等.Bcl-2蛋白家族和P53基因在细胞凋亡中的调控效应〔J〕.中国组织工程研究与临床康复,2007；11(10):1950-2.

9Yonekura I,Takai K,Asai A,etal.p53 potentiates hippocampal neuronal death caused by global ischemia〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab,2006；26(10):1332-40.

10周清安,李建生,王至婉,等.肾虚血瘀在老年缺血性中风发病中的地位及意义〔J〕.中国中医急症,2003；12(1):67-8.

11严一文.试论脑病(中风)从肾论治〔J〕.中国中医急症,2011；20(9):1450-4.

〔2014-11-17修回〕

(编辑李相军)

Impacts of modified Kongsheng Zhenzhong pills on apoptosis of neural cells in MCAO rats

WU Bing,WU Zhi-Chun,JI Xu-Ming,etal.

Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,Shandong,China

【Abstract】ObjectiveTo study the impacts of modified Kongsheng Zhenzhong pills on apoptosis,Bcl-2 and P53 expressions of neural cells in focal cerebral ischemia rats.MethodsThe model of middle cerebral artery occlusion(MCAO) was established by suture method.30 MCAO rats were randomly divided into model,ginkgo leaf and modified Kongsheng Zhenzhong pills groups.The neurological symptom scores were observed for the analysis of neural behavior.Fluorescent TUNEL assay was used to detect neural cells apoptosis.Immunohistochemistry was employed to determine the expressions of apoptosis-related protein Bcl-2 and P53.ResultsCompared with those of model group,the scores of Zea Longa and screen test,the apoptosis rate of neural cells and the expression of P53 were reduced,while the expression of Bcl-2 was increased significantly in modified Kongsheng Zhenzhong pills group(P<0.05).ConclusionsModified Kongsheng Zhenzhong pills could improve the nerve function injury of MCAO rats by modulating the expression of apoptosis-related protein and inhibiting the neuronal apoptosis.

【Key words】Modified Kongsheng Zhenzhong pills;Focal cerebral ischemia;Apoptosis;Bcl-2;P53

通讯作者：于华芸(1977-)，女，博士，硕士生导师，副教授，主要从事复方药理学研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(81202641)；山东省中医药科技发展计划项目(2009-006)

〔中图分类号〕R285.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015)22-6325-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.003