脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受体参与AM1241对CCI大鼠的镇痛效应



脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受体参与AM1241对CCI大鼠的镇痛效应

田虹1，黄婷婷2，刘正律2，陈远寿1，刘晓红1，曾俊伟1

(1.遵义医学院 基础医学院生理学教研室, 贵州 遵义563099；2.贵州省麻醉与器官功能保护重点实验室,贵州 遵义563099)

[摘要]目的 观察鞘内注射大麻素CB2受体激动剂AM1241对慢性坐骨神经结扎(CCI)大鼠机械痛阈、脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受体表达变化的影响。方法 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠40只随机分为5组(n=8): 假手术组、CCI组(坐骨神经结扎+ 鞘内注射0.005%DMSO生理盐水)、1 pmol/LAM1241处理组(坐骨神经结扎+鞘内注射AM1241 1 pmol/L)、10 pmol/LAM1241处理组(坐骨神经结扎+鞘内注射AM1241 10 pmol/L)、100 pmol/LAM1241处理组(坐骨神经结扎+鞘内注射AM1241 100 pmol/L)。CCI组及不同浓度AM1241处理组大鼠均于鞘内置管7 d之后行坐骨神经结扎，连续14 d 鞘内注射，每天2次；分别在术前1 d，术后第1、3、5、7、10、14天注射1 h后测定机械痛阈(MWT)，分别在术后第7，14天免疫印迹法(western blot)观察脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受体表达变化。结果 ①CCI组术后第1、3、5、7、10、14天MWT显著低于假手术组(P<0.05)，10 pmol/L AM1241和100 pmol/L AM1241 处理组术后第1、3、5、7天MWT明显高于CCI组(P<0.01)；但10 pmol/L AM1241处理组术后第10、14天MWT与CCI组相比无明显差异(P>0.05)；100 pmol/L AM1241 处理组术后第10、14天MWT仍高于CCI组(P<0.05)；②与假手术组相比，CCI组术后第7、14天脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受体表达显著上调(P<0.01)；与CCI组相比，100 mol/L AM1241处理组在术后第7天抑制脊髓背角P2Y12和P2Y13受体表达(P<0.05)，在术后第14天抑制背角P2X4受体表达(P<0.05)。结论 大麻素CB2受体激动剂AM1241的镇痛效应可能与抑制脊髓背角小胶质细胞P2X4、P2Y12和P2Y13受体表达有关。

[关键词]神经病理性疼痛；CB2受体；小胶质细胞

近年研究表明，大麻素CB2(Cannabinoid receptor 2)受体属于视紫红质G蛋白耦联受体家族，高选择性表达在脊髓背角小胶质细胞，参与了大麻类物质的镇痛效应[1-2]。CB2受体可能和许多G蛋白以及体内其他的效应系统耦联，从而参与调节实验动物足底注射致炎物质造成的炎性痛和外周神经神经损伤造成的病理性疼痛。在脊髓背角小胶质细胞还存在P2X4、P2Y12和P2Y13等多种嘌呤受体，有研究提示，鞘内分别注射P2X4受体反义核酸、P2Y12受体拮抗剂、P2Y13受体拮抗剂均可以减轻坐骨神经分支选择性损伤模型大鼠的热痛敏和机械痛敏[3]。P2X4受体是一种允许Na+、Ca2+内流的阳离子通道，P2Y12和P2Y13均属于视紫红质G蛋白耦联受体家族。然而，当伤害性信息到达脊髓背角时，CB2受体活化是否通过调节P2X4、P2Y12和P2Y13受体表达活动而发挥镇痛效应，目前尚不清楚。因此，本研究观察鞘内注射CB2受体激动剂AM1241对慢性坐骨神经结扎(The chronic constriction injury of the sciatic nerve, CCI)大鼠机械痛阈及脊髓背角小胶质细胞P2X4、P2Y12、P2Y13受体表达变化的影响，探讨CB2受体在神经病理性疼痛的作用和机制。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器AM1241购自Sigma，溶于DMSO中，使用前以生理盐水稀释至1、10、100 pmol/L；山羊P2Y12受体一抗和山羊P2Y13受体一抗购自abcam；小鼠Beta-actin单克隆抗体购自novus，抗羊HRP-IgG和抗小鼠HRP-IgG购自Santa Cruz，PE-10导管购自美国健康医疗仪器国际公司；vonFrey纤维丝购自中国医学科学院生物工程研究所。电泳仪、电泳槽、TRANS-BLOT SD半干电转移系统均为美国BioRad产品。

1.2实验动物分组健康成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠购自第三军医大学实验动物中心[许可证号SCXK(渝) 2007-0005]，体质量200～250g。大鼠40只随机分为5组(n=8): 假手术组(sham)、CCI 组(慢性坐骨神经结扎+ 鞘内注射0.005%DMSO生理盐水)、1pmol/LAM1241处理组(坐骨神经结扎+鞘内注射AM1241 1 pmol/L)、10 pmol/LAM1241处理组(坐骨神经结扎+鞘内注射AM1241 10 pmol/L)、100 pmol/LAM1241处理组(坐骨神经结扎+鞘内注射AM1241 100 pmol/L)。假手术组大鼠仅暴露坐骨神经不进行结扎。其余大鼠在鞘内置管7 d后进行坐骨神经结扎，术后分别给予0.005%DMSO生理盐水或不同浓度AM1241，连续14 d鞘内注射，每天2次(早晨9∶00，下午18∶00)。

1.3鞘内置管与CCI模型制作参照文献[4]，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠3 mL/kg，麻醉，俯卧位, 于腰3～4间隙作长约 3 cm 的皮肤纵切口，切开该处背棘肌的后筋膜, 钝性分离腰4棘突两侧肌肉，切除腰4棘突和邻近椎板, 暴露腰3、腰4棘突间隙，以25G针穿破黄韧带及硬脊膜，见清亮的脑脊液溢出。在破口处插入PE-10导管 2 cm (导管全长15 cm, 容量10 μL)，18G硬膜外穿刺针在大鼠皮下穿一隧道，导管的另一端送至颈背部，外露2 cm固定，外口用打火机封闭，防止脑脊液外溢。术后肌注青霉素8万单位，连续3 d，以防感染。大鼠清醒后出现双侧下肢瘫痪，则说明脊髓损伤，不纳入实验；术后第2天，经PE-10导管注入盐酸利多卡因(2%，20 μL)，大鼠双后足瘫软，30 min左右恢复，即为鞘内置管成功，进行下一步实验。

大鼠鞘内置管7 d后，腹腔注射1%戊巴比妥钠3 mL/kg，麻醉后俯卧位固定；在股骨外侧上方纵向切开皮肤，顺肌纹钝性分离肌肉，暴露坐骨神经，用5.0铬制羊肠线轻度结扎左坐骨神经干，共结扎4道，结扎间距约为1 mm；坐骨神经结扎的轻重程度判断标准为：①神经微凹陷；②结扎后线环均可移动；③结扎瞬间可见小腿肌肉轻颤。CCI术后出现运动异常如拖足行走或左下肢无法抬高等均剔除实验。术后大鼠3 d内肌注青霉素抗感染。

参考文献1.4机械痛阈测定[5]，各组大鼠分别于术前1 d、术后第1、3、5、7、10、14天测定大鼠机械痛阈：大鼠置于底部为金属网的有机玻璃箱内，适应环境至少30 min之后，用Von-Frey丝垂直刺激大鼠后肢足底5 s，刺激力量以触丝弯曲为准。采用up-down法测定机械痛阈，选择8根Von-Frey丝，标度分别为0.6、1、2、4、6、8、10和15g，大鼠出现抬足或舔足行为则为阳性反应，记录时间。测定首先从2g开始，当该力度的刺激不能引起抬足或舔足行为，则给予大一级力度的刺激; 如出现抬足或舔足行为则给予小一级力度的刺激，直至出现第1次阳性反应和阴性反应的骑跨,连续测定4次，平均值为阈值。最大力度为 15 g，每次刺激间隔30s。

1.5免疫印迹法在大鼠CCI术后第7、14天，乙醚麻醉处死大鼠，取CCI损伤侧腰段脊髓背角(L4-6)。RIPA法裂解组织，提取总蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。每孔上样量50 μg，SDS-PAGE 电泳，半干转仪将凝胶中的蛋白转移至 PVDF 膜上，加入山羊抗P2X4、P2Y12、P2Y13受体一抗(1∶500)，加入小鼠抗β-actin单抗(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜。PBS 洗膜，加入抗羊HRP-IgG(1∶2 500)和抗小鼠HRP-IgG(1∶2500)，室温反应1 h。加入化学发光剂后，X射线曝光显影。扫描分析软件系统(LabworksTMAnalysis Software) 分析数据，以每个条带的积分光密度(IOD) 值与相对应的β-actin的IOD值之比表示蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1鞘内注射AM1241 MWT的变化与假手术组相比，CCI组大鼠MWT在术后第1天迅速降低，并在14 d内持续处于低水平(P<0.01)；与CCI组相比，1 pmol/L AM1241处理组大鼠MWT变化不明显(P>0.05).10 pmol/L AM1241处理组MWT在术后第3、5、7天明显升高(P<0.05)；100pmol/L AM1241处理组MWT在术后第3、5、7 d升高更为明显(P<0.05)。在术后第10、14天，100 pmol/LAM1241处理组大鼠MWT升高减缓但仍高于CCI组(P<0.05，见图1)。机械痛测定说明AM1241以剂量依赖的关系发挥镇痛效应，在CCI早期镇痛效应更为明显。

*P<0. 05, **P<0. 01，与sham相比; +P<0. 05, ++P<0. 01与CCI相比。图1　鞘内注射AM1241后MWT的变化

2.2鞘内注射AM1241对CCI大鼠脊髓背角P2X4受体表达的影响在痛阈测定中，100 pmol/L AM1241表现了较好的镇痛效应，因此，western blot实验中，观察100 pmol/L AM1241鞘内注射后脊髓背角P2X4、P2Y12和P2Y13受体表达的变化。与假手术组相比，CCI组术后第7、14天，脊髓背角P2X4受体表达水平增强(P<0.01)；与CCI组相比，100 pmol/L AM1241处理组术后第7天时P2X4受体表达变化不明显(P>0.05)，在术后14 d时P2X4受体表达显著下调(P<0.05，见图2)。

A:Western blot检测P2X4受体蛋白表达;B: Western blot P2X4受体表达直方图分析。++P<0.01,与sham组比较; *P<0.05,与CCI组相比。图2　各组大鼠脊髓背角P2X4受体表达

2.3鞘内注射AM1241对CCI大鼠脊髓背角P2Y12和P2Y13受体表达的影响与假手术组相比，CCI组术后第7、14天脊髓背角P2Y12和P2Y13受体表达均出现明显上调(P<0.01)；与CCI组相比，100 pmol/L AM1241处理组术后第7天时P2Y12和P2Y13受体表达明显下调(P<0.01,P<0.05)；术后14 d P2Y12和P2Y13受体表达无明显差异(P>0.05，见图3、图4)。

A:Western blot检测P2Y12受体蛋白表达;B:Western blot P2Y12受体表达直方图分析。 ++P<0.01,与sham组比较; **P<0.01与CCI组相比。图3　各组大鼠脊髓背角P2Y12受体表达

A:Western blot检测P2Y13受体蛋白表达;B:Western blot P2Y13受体表达直方图分析。++P<0.01,与sham组比较; *P<0.05,与CCI组相比。图4　各组大鼠脊髓背角P2Y13受体表达

3讨论

脊髓作为疼痛中枢敏化的重要部位，对慢性疼痛的形成发挥重要作用，这其中存在多种机制的参与，特别是CB2的作用。以往研究报道，CB2受体激动剂MDA7、NESS400和JWH-133对于化疗药物紫杉酚造成的大鼠痛觉过敏以及脊神经结扎的小鼠痛觉过敏，具有良好的镇痛效应[6]。此前，有文献研究证明，鞘内注射AM1241并不能影响正常大鼠的机械痛阈或热痛阈[7]。在本实验结果显示，大麻素CB2受体激动剂AM1241显著减轻CCI大鼠的机械痛敏症状，表现出良好的镇痛效果。有关CB2R激活后发挥镇痛作用的机理，一般认为是抑制了痛觉感受神经元的敏感性和兴奋性，而且也抑制了背角胶质细胞的激活和随后的一些神经活性物质释放，从而使痛觉过敏减轻[8-9]。在本实验中，大麻素CB2受体激动剂AM1241在1～7 d以剂量依赖的方式显著减轻CCI大鼠的机械痛敏症状，表现出良好的镇痛效果；在7d之后，镇痛效应不佳。根据文献报道，在CCI大鼠，小胶质细胞急剧激活主要在3～7 d，而且CB2受体也主要存在于小胶质细胞[10]。由此推测，AM1241发挥镇痛效应的靶点可能是背角小胶质细胞。

在坐骨神经结扎以及施用gp120的神经痛大鼠，给予CB2受体兴奋剂AM1710可以抑制脊髓背角小胶质细胞激活和P38MAPK磷酸化，从而发挥镇痛作用[11]；本实验中，鞘内注射AM1241对于CCI大鼠7d的P2Y12和P2Y13受体表达表现了明显的抑制作用。大鼠的P2Y12与P2Y13受体相比，二者氨基酸序列一致性达到49%[12]，然而，Wilkerson 等人观察到，背角小胶质细胞P38MAPK磷酸化可以促进P2Y13受体基因表达，但对于P2Y12受体基因表达没有明显作用，可见影响这两种受体表达的因素并不一样[13]。P38MAPK磷酸化减弱很可能是CB2受体激活后抑制P2Y13受体表达的重要机制，但并不是抑制P2Y12受体表达的机制。由于CB2受体激活，导致了CCI痛敏状态下小胶质细胞P38MAPK磷酸化减弱，造成了P2Y13受体基因表达下降，蛋白合成减少。以往实验报道，CB2受体活化后可以与Gi/o藕联，可以抑制腺苷酸环化酶活性，胞内cAMP浓度降低，PKA活性下降；此外，有报道，CB2 受体激活可以增强LPS/IFN-γ诱导的小鼠小胶质细胞中细胞外信号调节激酶 1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)和氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)的激活[14]。在本实验中，CB2受体活化后哪些下游信号分子或蛋白激酶磷酸化有可能抑制P2Y12受体基因表达或蛋白合成，尚有待探索。在CCI术后7～14 d，星形胶质细胞或神经元释放的神经活性物质作用于小胶质细胞，也可以促进P2Y12和P2Y13受体表达上调，对此AM1241已经不能抑制。另外也提示，P38MAPK磷酸化并非影响P2Y13受体合成或表达的唯一因素。

P2X4受体是一种允许Na+、Ca2+内流的阳离子通道。在HEK-293细胞、海马神经元、C8-B4小胶质细胞、肺泡Ⅱ型细胞的胞膜、溶酶体、囊泡均有表达[15]。目前认为P2X4受体高选择性表达在脊髓背角小胶质细胞，在脊神经结扎、坐骨神经分支选择性损伤以及CCI大鼠均可见背角小胶质细胞P2X4受体与离子钙接头蛋白-1(ionized calcium binding adapter molecule 1，IBa-1)表达共定位且表达同时上调，P2X4受体激活后诱发脑源性神经生长因子(Brain derived neurotrophic factor, BDNF)释放，后者促进背角感觉传递神经元去极化，突触传递效能增加，参与中枢痛敏的形成与维持[16]。最近研究发现干扰素-γ以及干扰素调节因子-5(interferon regulatory factor-5, IRF5)可以促进小胶质细胞P2X4受体表达，丙戊酸可以抑制P2X4受体表达[17-18]。在本实验中，从AM1241并不影响CCI大鼠损伤早期P2X4受体表达来看，CB2与P2X4受体之间可能不存在直接的相互作用，P38MAPK磷酸化减弱也不影响P2X4受体基因表达或蛋白合成。但CCI大鼠损伤晚期，AM1241有可能抑制一些星形胶质细胞源性的神经活性物质刺激背角小胶质细胞P2X4受体表达的效应，所以，P2X4受体表达下调。

综上所述，大麻素CB2受体激动剂AM1241抑制了大鼠坐骨神经损伤造成的早期机械痛敏，其镇痛机制与调节嘌呤P2Y12和P2Y13受体相关。深入探讨CB2受体与P2受体相互作用及其机制，有助于我们深刻理解疼痛，为下一步研发以CB2或P2受体为靶点的新型镇痛药物提供新的思路。

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[收稿2015-04-07;修回2015-05-28]

(编辑：谭秀荣)

基础医学研究

基础医学研究

P2X4, P2Y12, P2Y13receptors in spinal dorsal horn are involved in AM1241 - induced analgesia in rats with chronic constriction injury

TianHong1,HuangTingting2,LiuZhenglv2,ChenYuanshou1,LiuHongtao1,ZengJunwei1

(1.Department of Physiology, Zunyi Medical University， Zunyi Guizhou 563099, China；2.Guizhou Key Laboratory of Anesthesia and Organ Protection, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate the effect of intrathecal injection AM1241, a selective CB2 (Cannabinoid receptor 2) receptor agonist, on mechanical withdrawl threshold (MWT) and the expression of P2X4, P2Y12and P2Y13receptors in spinal dorsal horn of rats with chronic constriction injury (CCI) of the sciatic nerve.Methods Forty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups (n=8): sham group (sham operation), CCI group (CCI+intrathecal injection of 0.005% DMSO saline solution), 1 pmol/L AM1241 group, (CCI+intrathecal injection of 1 pmol/L AM1241), 10 pmol/L AM1241 group (CCI+intrathecal injection of 10 pmol/L AM1241), 100 pmol/L AM1241 group (CCI+intrathecal injection of 100 pmol/L AM1241). Rats in CCI group and all AM1241 groups were treated with with chronic constriction injury of the sciatic nerve after 7d of intrathecal tude. The intrathecal injection was administered twice a day for 14 days. MWT were evaluated at 1, 3, 5, 7, 10 and 14d after surgery. The expression of P2X4, P2Y12and P2Y13receptors in dorsal horn was assessed by western blot at 7 and 14 post-operative days. Results 1)MWT in CCI group was significantly lower than sham group at 1, 3, 5, 7, 10 and 14d after surgery (P<0.05). MWT in 10 pmol/L AM1241 group was markedly longer than CCI group at 1, 3, 5, 7 d (P<0.01).MWT in 100 pmol/L AM1241 group was significantly longer than CCI group at 1, 3, 5, 7 d and 14d after surgery (P<0.01 at 1, 3, 5, 7 post-operative days; P<0.05 at 10, 14 post-operative days). 2)Compared with the sham group,the P2X4, P2Y12and P2Y13receptors expression in CCI group were markedly enhanced on 7d and 14d after surgery (P<0.01). Compare with the CCI group, the expression of P2Y12and P2Y13in 100 pmol/L AM1241 group was suppressed on 7d (P<0.01), the expression of P2X4in 100 pmol/L AM1241 group was suppressed on 14d after surgery (P<0.01).Conclusion Analgesia effect of cannabinoid CB2receptor agonist AM1241 may be related to the inhibition of the expression of P2X4, P2Y12and P2Y13receptors in the spinal dorsal horn microglial cells.

[Key words]neuropathic pain；CB2 receptor；microglial

[文献标志码][中图法分类号] R347.7 A

[文章编号]1000-2715(2015)03-0230-05

[基金项目]2012教育部科学技术重点项目(NO:2012125); 2010年贵州省科技厅资助项目(NO:黔科合J字(2010)2264) ; 遵义医学院重点学科项目(NO:XZXK-20120702); 遵义医学院大学生创新训练重点项目(NO：院发[2014]5807) 。[通信作者]曾俊伟，女， 博士, 副教授，研究方向：痛觉的神经化学机制，E-mail:junweizeng@sohu.com。