睾酮受体蛋白表达水平对高血压大鼠血管重构的影响*

于超男，王　颖#，燕树勋，杨国杰，张彦周，杨晓村，李　渊，孙丽娜

1)郑州大学第一附属医院老年病科；河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052　2)河南中医学院第一附属医院内分泌科 郑州 450008　3)郑州大学第一附属医院心血管内科 郑州 450052



睾酮受体蛋白表达水平对高血压大鼠血管重构的影响*

于超男1)，王颖1)#，燕树勋2)，杨国杰1)，张彦周3)，杨晓村1)，李渊1)，孙丽娜1)

1)郑州大学第一附属医院老年病科；河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 4500522)河南中医学院第一附属医院内分泌科 郑州 4500083)郑州大学第一附属医院心血管内科 郑州 450052

关键词高血压；睾酮受体；血管重构；丝裂原活化蛋白激酶；磷酸酶

摘要目的：探讨睾酮受体(AR)蛋白表达水平的改变对高血压大鼠血管重构(VR)的影响及其信号转导机制。方法：将30只大鼠随机分为对照组、假手术组、高血压组3组(每组10只)。采用“两肾一夹”法制备肾血管性高血压大鼠模型。HE染色观察主动脉组织形态结构，免疫组化法检测3组大鼠主动脉组织中AR、丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)蛋白表达水平。结果：与对照组相比，假手术组主动脉形态结构基本正常，AR、MKP-1蛋白表达水平无显著改变(P>0.05)；与对照组及假手术组相比，AR和MKP-1蛋白表达水平下降(P<0.001)；且在高血压组AR与MKP-1蛋白的表达呈正相关(r=0.657，P=0.039)，在对照组及假手术组无关(r=0.589和0.436，P>0.05)。结论：高血压VR过程中存在AR及MKP-1蛋白表达水平的改变。

AbstractAim: To explore the effect of the change of androgen receptor(AR) protein expression level on hypertensive vascular remodeling and the underlying mechanisms.Methods:Thirty rats were randomly allocated into 3 groups：control group, sham operation group and hypertensive group(10 rats in each group). The renovascular hypertensive rats model was established using the "2-kidney and 1-clip" method. Using tail-cuff method to measure the systolic blood pressure(pSB) and HE staining to observe the morphological structure of aorta, and the expressions of AR and MKP-1 were detected by immunohistochemical technique. Results: For the morphological structure, there was no significant difference between the control group and the sham operation group, and also no significant difference in the expressions of AR and MKP-1 was found between the two groups(P>0.05). Compared with the control group and the sham operation group，the vascular remodeling of the aorta in the hypertensive group was remarkable, and the expressions of AR and MKP-1 significantly decreased(P<0.001). In the hypertensive group, the expression of AR was positively correlated with the expression of MKP-1(r=0.657,P=0.039), and no such correlation was found in the control group or in the sham operation group(r=0.589，0.436，P>0.05). Conclusion: The vascular remodeling during hypertension is accompanied by the down-regulation of AR and MKP-1.

高血压血管重构(vascular remodeling，VR)是多种心血管疾病的病理基础[1]，对其机制的研究是高血压研究领域的热点之一。近年来的研究[2-3]结果显示睾酮与高血压VR的发生关系密切。睾酮是人体内重要的性激素之一，它的生物学活性主要是通过雄激素受体(androgen receptor，AR)实现的。已证实[4-6]睾酮与AR结合，通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路参与心肌肥大、血栓形成、动脉粥样硬化等多种疾病的发生。但其在高血压VR过程中的地位、作用及机制尚不清楚。为此，该研究以肾血管性高血压大鼠为研究对象，以AR为研究靶点，以MAPK的下游调节激酶——丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)为视点，探讨AR在高血压VR中的作用、地位及信号转导机制，为临床高血压VR的预防及治疗提供新的线索和理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物、主要试剂及仪器4周龄清洁级雄性Wistar大鼠30只，体重(75±5) g，由河南省实验动物中心提供(动物合格证号:0008508)。兔抗AR和MKP-1多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，抗兔IgG免疫组化检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)，DAB显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司)。其余产品均为市售分析纯。大鼠尾动脉测压仪(日本Softron公司，BP-98A型)，冰冻切片机(德国LEICA，CM 1900型)，烤片机(德国LEICA，HI 1220型)，Image-Pro Plus 6.0图像分析系统(Media Cybernetics公司)。

1.2动物分组与模型的建立大鼠随机分为对照组、假手术组、高血压组3组 (n=10)。采用“两肾一夹”法制备肾血管性高血压大鼠模型:水合氯醛(0.3 mL/kg)腹腔注射麻醉，大鼠仰卧固定于手术台上，备皮、消毒，打开腹腔，分离左侧肾动脉，内径0.2 mm的“U”型银夹钳夹左肾动脉，制作左肾动脉狭窄模型，腹腔注射青霉素钠，缝合。假手术组除不放置银夹外，其余操作步骤同上。所有大鼠均用标准饲料喂养，自由饮水，温度18～23 ℃，湿度50%～60%，人工昼夜(12 h/12 h)循环。术后每周测量血压1次，连续观察3周，以术后尾动脉收缩压(pSB)升高20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)(或>正常血压3个标准差)以上且同时>140 mmHg者为造模成功。

1.3血压测定和主动脉形态学观察①血压测定：在造模前、造模后第1、2、3及8周末，采用Tail-Cuff法测量各组大鼠安静、清醒状态下尾动脉pSB，每只测3次，取平均值。②取材和形态学观察：造模后第8周末，大鼠称重，经腹腔注射水合氯醛麻醉，开胸获取胸主动脉，洗涤，40 g/L多聚甲醛溶液固定。石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察并摄片，图像分析系统分析VR的指标，包括中层壁厚(MT)、管腔内径(LD)、中层壁厚/管腔内径(MT/LD)；选取3个视野，取平均值。

1.43组大鼠胸主动脉组织中AR和MKP-1蛋白表达的免疫组化测定石蜡包埋组织切片、脱蜡，冲洗；体积分数3%H2O2封闭，PBS漂洗；热修复抗原；正常山羊血清封闭，去液；滴加一抗(均按1100稀释)，4 ℃孵育过夜；室温复温，PBS漂洗；滴加抗兔IgG二抗室温放置30 min，PBS漂洗；DAB显色，冲洗，脱水，透明，封片。显微镜下观察并摄片，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定蛋白表达的平均光密度值。

1.5统计学处理采用SPSS 16.0进行分析，应用重复测量数据的方差分析比较3组大鼠尾动脉pSB的差异，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较3组VR指标、大鼠主动脉组织中AR及MPK-1蛋白表达水平的差异，两因素相关性分析采用Pearson检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.13组大鼠尾动脉pSB比较见表1。各组大鼠术前尾动脉pSB差异无统计学意义。与各组相应的术前pSB相比，高血压组pSB逐渐升高，而对照组及假手术组差异无统计学意义。与对照组相比，8周末时，高血压组pSB升高显著，而假手术组pSB差异无统计学意义。

表1　3组大鼠尾动脉pSB的比较　mmHg

F组间=1 211.779，F时间=1 613.225，F交互=1 537.050，P<0.001；*：与对照组相比，P<0.05。

2.23组大鼠主动脉形态学比较见图1、表2。对照组大鼠主动脉形态大致正常，各层分界清晰，内膜光滑，中膜无增厚，弹性纤维呈层状排列整齐，平滑肌排列均匀有序、无增生肥大；与对照组相比，高血压组主动脉内皮细胞增生、排列紊乱，部分内皮细胞脱失，中膜增厚明显，血管平滑肌细胞增生肥大且排列紊乱，弹性纤维扭曲、紊乱，而假手术组无明显改变。与对照组相比，高血压组MT、MT/LD明显增加，LD减小；而对照组与假手术组相比，差异无统计学意义。

图1　3组大鼠主动脉HE染色(×400)A：对照组；B：假手术组；C：高血压组。

表2　3组大鼠VR指标的比较

*：与对照组和假手术组相比，P<0.001。

2.33组大鼠AR和MPK-1蛋白表达的比较见图2和表3。对照组主动脉内存在基础量的AR蛋白表达(棕黄色颗粒物，如图箭头所示)，且AR在动脉各层均有表达，以内层为主，主要位于细胞核内；MKP-1蛋白(棕黄色颗粒物，如图箭头所示)各层均可见。与对照组相比，高血压组AR蛋白及MKP-1蛋白的表达明显下降，假手术组变化无统计学意义。Pearson相关分析显示，在高血压组AR与MKP-1呈正相关(r=0.657，P=0.039)，在对照组及假手术组无相关关系(r=0.589和0.436，P>0.05)。

图2　3组大鼠主动脉组织中AR和MKP-1蛋白的表达(SP，×400)1：AR蛋白；2：MKP-1蛋白；A：对照组；B：假手术组；C：高血压组。

表3　3组大鼠主动脉组织中AR和MPK-1蛋白表达水平的比较

*：与对照组和假手术组相比，P<0.001。

3讨论

高血压VR是高血压靶器官损害的重要病理生理基础[7]，严重影响高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等多种疾病的预后。目前高血压治疗策略不只局限于降低血压，也关注对高血压VR的防治，故对其机制深入探讨研究意义重大。

近年来的研究[8-10]表明，睾酮不仅对生殖系统发挥调节作用，而且与冠心病、高血压病等多种心血管疾病及其危险因素密切相关。既往课题组研究[11]证实，睾酮能抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌成纤维细胞增殖及胶原合成，其生物学效应与抑制MAPK过度激活有关，提示睾酮有心血管保护作用。

睾酮的生物学效应主要是通过AR介导的。AR是配体调节的转录因子，属于核受体超家族成员，大多通过基因途径调控细胞内基因表达而发挥生物学效应。已证实[12]AR广泛存在于睾丸间质细胞、神经系统、肾脏、心肌、主动脉、冠状动脉、血管平滑肌细胞及巨噬细胞、单核细胞、血小板等。该研究发现在正常大鼠主动脉壁各层内均存在基础量的AR表达，主要分布于内层；在肾血管性高血压大鼠重构的主动脉中，AR蛋白表达水平下调，提示AR蛋白表达水平的改变参与了VR的发生过程，这与既往的研究[13]结果相符。Ikeda等[2]研究发现，在AR基因敲除鼠，AngⅡ刺激显著增加主动脉内胶原表达，引起中膜厚度增加及血管纤维化，进而导致VR的发生；同时也增加过氧化物物质、脂质过氧化等诱导VR的发生，且该过程伴有NO生物利用度的下降，提示AR通过多种途径影响VR的发生。

MAPK是细胞外重要的信号传导通路之一。以往的研究[14]证实，MAPKs过度激活在高血压VR过程中发挥重要作用。MKP-1是MAPKs的特异性调节磷酸酶，负责MAPKs的失活，在维持MAPKs活性水平的动态平衡中发挥重要作用。课题组既往研究[15]已证实，在高血压左室重构的发生、发展过程中，不仅仅存在MAPKs的过度激活，同时还合并MPK-1表达下降，即表现为在重构的心血管组织中MKP-1的表达可诱导性减低，导致MAPKs灭活障碍。为此，该研究选择MKP-1蛋白表达水平为信号转导通路的一个观察点。研究发现在正常组织中存在基础量的MKP-1蛋白表达，在重构的血管中MKP-1蛋白表达下调，并且该现象与AR蛋白表达下调共存，进一步的相关分析证明在高血压组AR与MKP-1的表达呈正相关。由此推测，在高血压VR过程中，AR与MAPK信号转导偶联、相互作用，共同推进了该过程的发生发展。

综上所述，在高血压VR过程中，存在AR及MKP-1蛋白表达水平的下降。提示AR蛋白表达下调参与了高血压VR过程，并证实与MAPK信号通路偶联。这可能为临床高血压VR及靶器官损害的防治提供新线索和新的药物靶点。

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*国家自然科学基金项目31160193;云南省教育厅科学研究基金项目2010Y398;云南省应用基础研究面上项目2010ZC055,2012FB135

Effects of androgen receptor protein expression level on hypertensive vascular remodeling in rats

YUChaonan1),WANGYing1),YANShuxun2),YANGGuojie1),ZHANGYanzhou3),YANGXiaocun1),LIYuan1),SUNLina1)

1)DepartmentofGeriatrics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity；Key-DisciplinesLaboratoryofClinical-MedicineofHenan，Zhengzhou4500522)DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,theFirstAffiliatedHospital,HenanCollegeofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou4500083)DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordshypertension；testosterone receptor；vascular remodeling；mitogen-activated protein kinase；phosphatase

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.004

中图分类号R544.1

通信作者#，女，1974年6月生，博士，教授，主任医师，研究方向：心肌重构的机制及防治，E-mail:2414714561@qq.com