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犬细小病毒病毒样颗粒的研究进展

2016-01-28陈进会刘国庆颜其贵陈珍容

质量安全与检验检测 2016年4期
关键词:免疫原性细小疫苗

陈进会刘国庆颜其贵陈珍容*

(1.东莞出入境检验检疫局广东东莞523072;2.四川农业大学动物医学院)

犬细小病毒病毒样颗粒的研究进展

陈进会1刘国庆1颜其贵2陈珍容2*

(1.东莞出入境检验检疫局广东东莞523072;2.四川农业大学动物医学院)

研究人员为防控犬细小病毒病的传播研制了多种不同形式的候选疫苗,其中病毒样颗粒是具有较好应用前景的一种候选疫苗,本文就其制备方法及免疫原性的研究进展进行概述。

犬细小病毒;病毒样颗粒;疫苗

1 前言

犬细小病毒病是由犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一种具有高度接触性传染的烈性传染病,以剧烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少以及心肌炎为主要特征,发病率高,传染性强,死亡率高,是危害我国养犬业最为严重的传染病之一[1]。1978年5月,CPV首次在两只病犬体内被检测到,其中一只新生幼犬由于心肌炎突然死亡,另一只两月龄以上幼犬由于严重腹泻而脱水死亡,同时该病毒感染了全球不同地区的野生犬及家养犬[2,3]。1982年,我国梁士哲等[4]最早报道了类似CPV所致的犬出血性肠炎,1983年徐汉坤等[5]确认本病的流行。CPV主要感染犬,其他犬科动物,如郊狼、丛林犬、食蟹狐和鬣狗等也可以感染。随着病毒抗原漂移,病毒已经可以感染小熊、貉、大熊猫等动物,严重威胁了家犬、经济动物和珍稀野生动物的安全[6]。

自1978年以来,CPV作为一种地方性流行性疾病肆虐全球,虽然疫苗接种能够在一定程度上保护幼犬,但野生型的病毒仍旧不能得到控制。预防CPV病的疫苗最早是使用经福尔马林灭活的猫泛白细胞减少症病毒疫苗,也有弱毒疫苗,但免疫效果远不如同源疫苗。目前基本上是用同源疫苗,已有部分活疫苗、灭活疫苗商品化,国内主要采用国产或进口的CPV弱毒疫苗进行免疫。但弱毒疫苗存在一些缺点:对一些个体如免疫缺陷者可能诱发严重的疾病;可能滞留在环境中造成环境污染从而引发交叉感染;弱毒疫苗稳定性较差,可能会出现毒力反祖现象;保存、运输条件要求较高[7]。随着黏膜和全身递送佐剂、脂质体、蛋白/多肽包胶、复合抗原多肽及病毒样粒子等的逐步应用,研发可部分取代活苗的高效非活性疫苗成为可能[8-10]。其中病毒样颗粒(Virus-Like Particles,VLPs)疫苗是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒,没有病毒的核酸(DNA/ RNA),不能自主复制,其在形态上与真正病毒粒子相同或相似,可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力[11],近年来发现多数病毒的衣壳蛋白基因在真核表达系统以及少数病毒的衣壳蛋白基因在原核表达系统中都能够有效地实现自我组装,这为病毒的基础研究(基因治疗、药物治疗等)及疫苗的开发提供了便利条件。

2 CPV的结构蛋白及VLPs的免疫特性

CPV基因组为单股负链DNA,全长5323nt。CPV基因组包括2个开放阅读框(ORF),5′端ORF编码非结构蛋白(668个氨基酸),即早期转录的调节蛋白(NS1和NS2);3′端ORF编码结构蛋白(722个氨基酸),即晚期转录的病毒衣壳蛋白(VP1和VP2)。整个编码区基因相互重叠,结构基因和非结构基因有各自独立的启动子区域,即晚期启动子和早期启动子。CPV结构含有TATA序列转录起始区和刺激蛋白SP1的结合位点,这些序列的转录激活对于启动子的活性具有重要的作用。CPV基因组另一显著特点是3′端和5′端各有一个发夹样的回纹结构,一般由120 bp-160 bp碱基组成,但整个发夹结构又被两个短的回纹序列中断,因而末端序列可折成T形或Y形结构,这一结构对病毒的复制十分重要[12]。

CPV基因主要编码4种蛋白(VP1,VP2,NS1,NS2),其中VP1和VP2为结构蛋白,NS1和NS2为非结构蛋白。病毒空衣壳中只含有VP1和VP2两种蛋白,VP2是构成衣壳蛋白的主要成分,位于VP1的C端,VP1蛋白的C端氨基酸和VP2蛋白的N端氨基酸序列相互重叠,且二者终止于同一密码子。VP1和VP2蛋白在病毒感染过程中起着极为重要的作用,缺失VP1或VP2蛋白的突变体均丧失了对宿主细胞的再感染性。此外,成熟的病毒粒子还含有VP3蛋白,VP3是VP2的裂解物,它只在衣壳装配和病毒基因组包装后才出现。研究较多的主要是VP2结构蛋白,CPV的中和抗原位点位于VP2上,VP2蛋白是CPV的免疫原性蛋白,编码CPV的主要抗原决定簇,可诱导机体产生中和抗体。VP2基因的N端以及该基因上的蛋白转角结构区loop1和loop3是重要的B细胞抗原表位区,可诱导机体产生中和抗体。VP2基因全长1755 nt,编码584个氨基酸,VP2上的几个关键碱基和氨基酸的变化就会改变抗原特性和宿主范围。结构和功能研究表明,衣壳上的纤突决定着细胞向性、宿主范围和进化,这些区域氨基酸残基的变化是导致CPV毒株抗原漂移的主要原因[13]。

研究表明,特定情况下,单独表达CPV VP2蛋白可以自组装成VLPs,且形态上类似于天然病毒。利用CPV VP2蛋白获得的VLPs,不仅保持了免疫原性,而且能够模拟CPV自然病毒粒子感染途径,通过VP2蛋白与细胞表面特异受体的结合实现CPV VLPs的靶向定位或载运。VLPs没有感染性,作为免疫原,它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应,而宿主、病毒和疫苗因素共同决定VLPs产生的机体防护水平[14]。

3 CPV-VP2 VLPs的制备方法

对病毒感染性疾病而言,VLPs是一种理想的疫苗形式。形态上,VLPs类似未成熟的病毒粒子;功能上,具有天然病毒的类似嗜性,通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,激发强有力的特异性体液和细胞免疫[15]。目前获准用于人类的VLPs疫苗包括乙型肝炎病毒疫苗、人乳头瘤病毒疫苗和戊型肝炎病毒疫苗,已在人群中广泛应用并取得良好效果。同时,许多病毒的VLPs也被用于基础性研究,如病毒的组装机制及结构研究、病毒与宿主或蛋白与蛋白之间的相互作用[16]。多种表达系统可用于制备VLPs,包括原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒/昆虫细胞表达系统(B/IC)、哺乳动物细胞表达系统和转基因植物。

3.1B/IC系统

B/IC系统是以杆状病毒为外源基因载体,昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。杆状病毒能容纳大片段的外源基因,关闭宿主细胞早期基因转录而高水平表达目的蛋白,并能进行翻译后修饰。重组杆状病毒制备简单、快速,能在10-12周内完成新病毒VLPs疫苗的生产,特别是一些表面蛋白易于突变的病毒如流感病毒、冠状病毒等。B/IC系统的主要缺点是同时表达大量难以与VLPs分离的杆状病毒粒子,其具有佐剂活性,如果不去除或灭活,能显著增加VLPs的免疫原性[17,18]。除此之外,超速离心是纯化VLPs的主要方法,难以满足大规模生产的需求。

Chouday等[19]利用蚕蛹幼虫成功表达了CPV VLPs,经接种小鼠后证实该VLPs具有较强免疫原性。胡桂秋[20]利用B/IC系统表达了CPV-VP2蛋白,并且该蛋白能在体外自动组装成VLPs。随后分别在豚鼠和犬两种动物模型中,通过口服和肌注两种途径免疫,对CPV VLPs的免疫原性进行评价,为将来CPV的亚单位疫苗生产提供依据。王亚君等[21]应用PCR方法扩增CPV-VP2基因,将其克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的转移载体pFastBacHTc上,命名为pFastBacHTc-VP2,将人工合成的犬瘟热病毒(CDV)抗原表位基因T.TB克隆至VP2基因的上游,命名为pFastBacHTc-T.TB-VP2,进而转入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得携带CDV T.TB细胞表位和CPV-VP2基因的重组转染质粒Bacmid-BacHT-T.TB-VP2,将其转染昆虫细胞Sf-9后获得融合重组T.TB-VP2蛋白,大小约为70 ku。经Western blot分析,结果显示:表达的蛋白具有良好的免疫原性。表达的重组蛋白在无佐剂参与的情况下,按确定的免疫程序免疫6-8周龄的BALB/c小鼠,检测小鼠的体液免疫学指标。结果表明:表达蛋白能诱导小鼠产生抗CDV和CPV的特异性中和抗体。这为重组CDV与CPV新型亚单位疫苗的研制奠定了重要的物质基础。冯昊等[22,23]将狂犬病病毒(RV)、CDV、CPV嵌合体VLPs在昆虫细胞中进行表达,使用该VLPs免疫小鼠,经间接免疫荧光、血凝抑制试验及电子显微镜检测,结果表明B/IC系统下的CPV嵌合体VLPs成功获得且具有高免疫原性。

3.2酵母细胞表达系统

在过去的20年中,甲醇营养型毕赤酵母表达系统已经成为非常成功的外源蛋白表达系统,表达了数以千计的重组蛋白。与其他真核表达系统相比,毕赤酵母具有遗传操作方便、培养基成分简明和适合高密度发酵等优点。贺英等[24]采用PCR方法对CPV-VP2基因进行扩增,将CPV-VP2基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPICZAA中,构建真核重组表达载体pPICZAA-VP2,将该重组质粒线性化后,转入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33中,甲醇诱导表达CPV-VP2,SDS-PAGE和Western-blotting鉴定表达蛋白。结果显示,成功扩增了CPV-VP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZAA-VP2,在毕赤酵母菌中表达出约68000蛋白。经Westernblotting鉴定表明,表达蛋白为目的蛋白VP2。表达菌株扩大表达体系于培养基中培养,上清液用70%过硫酸铵4℃沉淀浓缩,采用His选择镍-亲和层析柱分离纯化获得重组酵母表达的带组氨酸标签的VP2蛋白,表达量约3mg/L。结果表明,在毕赤酵母中成功地表达了CPV-VP2蛋白,且能被CPV-VP2单克隆抗体特异识别。但该试验未进行深入研究,重组毕赤酵母菌所表达的CPV-VP2蛋白在体外是否能够自组装成VLPs有待进一步研究。

3.3原核表达系统

在原核表达系统中,应用较多的是大肠杆菌表达系统。大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率、生长繁殖快、成本低廉,可以快速大规模地生产目的蛋白等优点,而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统,表达目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30%,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。

利用大肠杆菌表达系统构建表达CPV VLPs的研究已取得初步进展。程言信[25]对CPV VP2基因分段进行原核表达,经超声处理后SDS-PAGE电泳证明了K2和K4片段获得了良好的可溶性表达,经过间接ELISA、Western blot鉴定,表明采用大肠杆菌原核表达系统所表达的融合蛋白具有与CPV阳性抗体特异结合的良好抗原性。陈胜男[26]成功克隆了CPV VP2基因,将VP2基因成功构建到原核表达质粒pGEX-4T中,即pGEX-4T-VP2,将该质粒转化到E.coli BL21中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-Blotting分析,结果表明,诱导表达的pGEX-4T-VP2阳性菌株可表达出大小为90 kDa蛋白,该重组蛋白具有反应活性。用谷胱甘肽琼脂糖4B亲和层析柱纯化目的蛋白,免疫小鼠后,ELISA结果显示GST-VP2融合蛋白抗血清效价随着免疫次数的增加而升高,表明得到的重组蛋白具有很好的免疫原性。Xu等[27]利用PCR方法成功扩增CPV VP2基因,将VP2基因克隆到pSMK载体中,从而获得重组表达质粒pSMK-VP2,将该质粒转入BL21宿主菌中16℃低温诱导表达,用镍亲和层析柱分离、纯化CPV VP2蛋白来去除His标签,然后将纯化后的蛋白和SUMO蛋白酶按一定比例混合切除上述两种标签后,利用VP2结构蛋白在体外自组装的特性形成VLPs。经透射电子显微镜鉴定表明,体外环境自组装成的CPV VLPs具有与天然病毒相似的颗粒状结构。接种小鼠后淋巴细胞分类检测结果显示,该系统下产生的CPV VLPs具有免疫原性,能够刺激机体产生良好的体液和细胞免疫反应。

4 结语

采用基因工程和细胞培养技术的VLPs疫苗是人类病毒疫苗史上的一大突破,与传统的减毒或灭活疫苗相比,高度纯化的VLPs疫苗具有组分单一,不含有病毒核酸,良好的安全性和质量可控等显著优点,但是研究难度更大,虽然有数十种VLPs在实验室中成功制备,却只有极少数能够在疫苗应用中取得突破,获得合适的放大制备工艺、组装工艺和制剂工艺组合是阻碍其发展的重要原因[28]。

近30年来,VLPs大规模制备与纯化技术已得到快速发展,迄今已有110余个VLPs被制备及应用评估。VLPs除了可以直接作为免疫原外,还可作为载体转运一些小分子,像肽链、DNA分子,也可在粒子表面展示抗原表位。目前多种VLPs已作为疫苗使用,同时也作为其他小分子的转运载体[29]。VLPs的特殊结构决定其能有效的被抗原递呈细胞摄取,并刺激机体产生持久的细胞免疫和体液免疫。

CPV VLPs类似于天然病毒,能提呈多种构象表位,诱导有效的体液和细胞免疫反应,其疫苗稳定性好,不易失活,具有广阔的发展前景。培养操作简单、生长繁殖快、成本低廉的大肠杆菌表达系统是制备VLPs的首选,虽然大肠杆菌表达系统在制备和组装大尺度、结构复杂的VLPs方面仍然存在诸多问题,但是从蛋白质结构优化和分子设计入手,同时进行大肠杆菌的外源表达调控机制相关的功能基因改造,使其更适合VLPs的表达和组装。其抗原选择及制备工艺有待进一步优化,VLPs疫苗的应用策略与免疫保护效果仍有待在小鼠感染模型验证与改进。但无论如何,基于大肠杆菌的戊型肝炎疫苗和HPV疫苗的成功研制给予人们信心和鼓舞[30,31],相信最简单的大肠杆菌表达和最接近病毒免疫功能的VLPs技术相结合,将带来一个全新的开始。

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Progress on the CPV VP2 Virus-Like Particles-Based Vaccine

CHEN Jinhui1,LIU Guoqing1,YAN Qigui2,CHEN Zhenrong2*
(1.Dongguan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Dongguan,Guangdong,523072;2.Veterinary Medicine College of Sichuan Agricultural University)

Several novel vaccines have been developed to prevent virus spreading,and the virus-like particles(VLPs)of CPV VP2 was one of most prom ising vaccine candidate.We here w ill give a brief review on the preparation and immunogenicity of VLPs-based CPV vaccine.

Canine Parvovirus;Virus-Like Particles;Vaccine

S852.65

E-mail:chenjinhui@dg.gdciq.gov.cn;通讯作者E-mail:czr777@126.com

教育部《长江学者和创新团队发展计划》创新团队项目(IRTO848)

2016-02-23

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