芬太尼与5-氟尿嘧啶联合诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡及其机制

王志学　张晓侠　雷　燕　刘新伟　李汝泓

(承德医学院附属医院麻醉科，河北　承德　067000)



芬太尼与5-氟尿嘧啶联合诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡及其机制

王志学张晓侠雷燕1刘新伟李汝泓

(承德医学院附属医院麻醉科，河北承德067000)

摘要〔〕目的研究芬太尼与5-氟尿嘧啶(FU)联合应用对MCF-7乳腺癌细胞凋亡的影响及内、外源性途径的调控机制。方法作用48 h后通过流式细胞技术(FCM)检测Annexin V-EGFP/PI染色的细胞凋亡情况，通过免疫细胞化学检测Bcl-2、Bax、Fas表达情况。结果单独应用芬太尼时1 μmol/L与10 μmol/L浓度组凋亡率均增加(P<0.05，P<0.01)，Bcl-2表达减弱(P<0.05，P<0.01)、Bax表达增强(P<0.01)、Fas表达增强(P<0.01)；单独应用500 μmol/L 5-FU后凋亡率亦明显增加(P<0.01)，Bcl-2表达减弱(P<0.01)、Bax、Fas表达增强(P<0.01)；联合应用芬太尼与5-FU，协同作用在3组均显现(P<0.05，P<0.01)。结论芬太尼、5-FU在一定浓度范围内单独或联合应用可促进MCF-7乳腺癌细胞凋亡，并使Bcl-2表达下调，Bax、Fas表达上调。联合应用两类药物可能在内源性、外源性途径调控细胞凋亡上显示协同效应。

关键词〔〕芬太尼；5-氟尿嘧啶；MCF-7；凋亡；Bcl-2；Bax；Fas

1承德医学院附属医院手术部

第一作者：王志学(1978-)，男，医学硕士，主治医师，讲师，主要从事癌痛治疗对肿瘤生物学行为影响方面的研究。

综合治疗乳腺癌的研究中，人们更关注用于癌痛治疗的阿片类药物对化疗药物抗肿瘤作用的影响。笔者前期的一些研究证实〔1～6〕，单独或联合应用吗啡、5-氟尿嘧啶(FU)，在一定浓度范围内能抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖；联合应用两类药物，可通过在细胞周期G0/G1期到S期转化的抑制、S期向G2M期转化的抑制上表现出对细胞周期影响的协同效应；单独或联合应用吗啡、5-FU，在一定浓度范围内可促进MCF-7乳腺癌细胞凋亡，并使Bcl-2表达下调，Bax、Fas、Caspase-8表达上调，联合应用两类药物可能在内源性、外源性途径调控细胞凋亡上显示协同效应。同为阿片类药物的芬太尼，因为具有更多的剂型和工艺不断出现，近年来更多地用于癌痛治疗。以往的研究指出〔7～9〕，其也能剂量依赖性地抑制MCF-7人乳腺癌细胞增殖、促进其凋亡，并能使肿瘤细胞所致的组织破坏显著减少。然而，芬太尼与5-FU联合应用是否也有吗啡类似的效应尚有待阐明。对于此，笔者前期也做了相关实验〔10〕。本文将对芬太尼与5-FU联合应用对凋亡的影响以及内、外源性途径的机制进行相关探讨。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要试剂和仪器PI(碘化丙啶)，Sigma公司(美国)；Annexin V-EGFP，凯基公司(南京)；胎牛血清、胰蛋白酶，天津血液学研究所；RPMI1640培养基，GIBCOBRL公司(美国)；鼠抗人Bcl-2、Bax、Fas免疫化学单克隆抗体，迈新公司(福州)。FACSCalibur流式细胞仪，B&D公司(美国)； YT-CJ-1N超净工作台，亚泰科隆实验科技开发中心(北京)； CO2电热恒温培养箱， SANYO公司(日本)； LD5-IA低速离心机、QL-901振荡器，雷勃尔公司(北京)；倒置显微镜、光学显微镜，OLYMPUS(日本)；数码摄像系统、显微采图系统、荧光倒置显微镜，尼康(日本)； Mivnt显微图像分析系统，微宇公司(珠海)。

1.1.2实验药物5-FU注射液，旭东海普药业(上海)；枸橼酸芬太尼注射液，人福药业(宜昌)。

1.1.3实验细胞MCF-7人乳腺癌细胞，凯基公司(南京)。

1.2方法

1.2.1细胞培养成功复苏细胞后，调整其浓度为1×106/ml，于培养瓶接种，在5%CO2、温度37℃、湿度100%的电热恒温培养箱内静置，以RPMI1640完全培养液培养，并隔日更换培养液。待观察到70%～80%贴壁时，用0.25%胰蛋白酶消化并进行传代。

1.2.2实验分组MCF-7细胞分别用含不同种类或浓度实验药物的RPMI1640完全培养液培养，共分为8组：仅以RPMI1640培养液培养即未处理组(U组)，含0.1 μmol/L(低浓度)芬太尼的培养液处理组(LF组)，含1 μmol/L(中浓度)芬太尼的培养液处理组(MF组)，含10 μmol/L(高浓度)芬太尼的培养液处理组(HF组)，含500 μmol/L 5-FU的培养液处理组(FU组)，含0.1 μmol/L(低浓度)芬太尼与500 μmol/L 5-FU的培养液联合处理组(LF+FU组)，含1 μmol/L(中浓度)芬太尼与500 μmol/L 5-FU的培养液联合处理组(MF+FU组)，含10 μmol/L(高浓度)芬太尼与500 μmol/L 5-FU的培养液联合处理组(HF+FU组)。

1.2.3FCM检测Annexin V-EGFP/ PI染色的细胞凋亡情况取处于对数生长期的MCF-7细胞，将其浓度调整为5×105/ml，在25 ml细胞培养瓶中接种，观察细胞贴壁后，用含不同种类或浓度实验药物的RPMI1640培养液5 ml换液(见1.2.2)，孵育48 h，每组5瓶。48 h后将上清吸弃，细胞消化、PBS洗涤，在离心管中收集约106/ml以上的细胞；4℃ 1 500 r/min低速离心5 min后将上清弃去， 以500 μl的Binding缓冲液重悬，再加入Annexin V-EGFP 5 μl及PI 5 μl，混匀，在室温避光反应15 min；后1 h内上机用流式细胞仪检测。

1.2.4细胞免疫化学检测Bcl-2、Bax、Fas表达另取处于对数生长期的MCF-7细胞，将其制备为单细胞悬液，准确计数，调整到约为4×105/ml的细胞浓度，在1 cm×1 cm盖玻片(已预先置于培养皿中)上接种，每片0.5 ml。观察贴壁后，向培养皿中分别加入含不同种类或浓度实验药物的RPMI1640培养液(见1.2.2)孵育48 h。48 h后4℃丙酮固定大于20 min、自然风干，PBS冲洗；50 μl 13%过氧化氢孵育，PBS再冲洗；然后用50 μl血清封闭20 min。除去血清，加50 μl一抗，4℃过夜，次日PBS冲洗。加50 μl二抗，室温环境下孵育15～20 min后PBS冲洗。加100 μl新鲜配制的DAB溶液，在显微镜下观察3～5 min。苏木素复染，返蓝，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。用Nikon Eclipse 50i显微采图系统对染色后载玻片上的Bcl-2、Bax、Fas免疫阳性物进行采图，再以MiVnt显微图像分析系统对其定量分析。每个对照组或实验组测量5张玻片，200倍镜下对每张玻片随机选取5个不同视野成像，检测其平均灰度级，即代表1张玻片上阳性细胞平均灰度(AGL)。AGL数值越大，蛋白表达水平越低。

1.3统计学分析采用SPSS11.5软件进行单因素方差分析与析因设计方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2结果

2.1凋亡率变化情况与U组相比，1 μmol/L及10 μmol/L的芬太尼单独处理48 h凋亡率均增加(P<0.05，P<0.01)；500 μmol/L 5-FU单独处理48 h，凋亡率亦增加(P<0.01)。联合应用不同浓度芬太尼与500 μmol/L 5-FU 处理48 h，较各自单独处理组相比，凋亡率亦均明显增加(P<0.01)，且均显示出协同效应(P<0.01)；随其中芬太尼浓度增加，凋亡率依次增加。见表1。

2.2免疫细胞化学染色检测Bcl-2、Bax、Fas蛋白表达情况免疫细胞化学染色检测Bcl-2蛋白表达时，U组的绝大多数细胞质可见棕黄色的染色，数据显示为最小的AGL、最强的Bcl-2表达。芬太尼单独处理48 h，胞质棕黄色染色随着芬太尼浓度的增加依次减浅、AGL随之增加。免疫细胞化学染色检测Bax蛋白表达时，U组的绝大多数细胞质可见棕黄色染色不明显，数据显示为最大的AGL、最弱的Bax表达。芬太尼单独处理48 h，胞质棕黄色染色随着芬太尼浓度的增加依次加深、AGL随之降低。免疫细胞化学染色检测Fas蛋白表达时，U组的绝大多数细胞质可见棕黄色染色不明显，数据显示为最大的AGL、最弱的Fas表达。芬太尼单独处理48 h，胞质棕黄色染色随着芬太尼浓度的增加依次加深、AGL随之降低。与U组相比，1 μmol/L及10 μmol/L浓度的芬太尼均能减弱Bcl-2表达、增强Bax、Fas表达(P<0.01)。500 μmol/L 5-FU单独处理48 h，与未处理组相比亦能减弱Bcl-2表达、增强Bax、Fas表达(P<0.01)。联合应用不同浓度芬太尼与500 μmol/L 5-FU处理48 h，较各自单独处理组相比，均能明显减弱Bcl-2表达、增强Bax、Fas表达(P<0.01)，且均显示出协同效应(P<0.05)；且随其中芬太尼浓度增加，Bcl-2表达依次减弱，Bax、Fas表达依次增强。见表1。

组别细胞凋亡率(%)Bcl-2AGLBaxAGLFasAGLU组3.394±0.900144.183±3.903260.783±20.622270.654±13.213LF组3.682±0.939148.490±4.025256.072±7.252268.411±14491MF组5.040±0.6981)164.191±8.7531)219.307±12.3582)228.099±9.1712)HF组9.020±1.0652)194.176±8.2642)197.957±9.7442)194.626±11.3282)LF+FU组18.352±2.1192)3)5)224.226±17.4322)3)4)156.639±12.2262)3)4)161.199±10.6072)3)4)MF+FU组21.862±2.3612)3)5)245.779±33.9302)3)4)132.345±5.7892)3)4)131.814±6.8522)3)4)HF+FU组28.478±3.0862)3)5)266.635±26.7762)3)4)105.809±9.1962)3)4)100.329±4.6362)3)4)FU组12.210±1.7382)168.491±9.4932)191.380±12.0792)192.625±10.8002)

与U组相比：1)P<0.05，2)P<0.01；与相应单独处理组相比：3)P<0.01；协同作用出现：4)P<0.05，5)P<0.01

3讨论

阿片类药物通过多种机制影响肿瘤细胞生长，芬太尼抑制肿瘤生长的机制之一即是诱导凋亡〔7～9〕。化疗的代表药物5-FU可通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡亦早已证实。本研究发现，芬太尼、5-FU在一定浓度范围内单独或联合应用可促进MCF-7乳腺癌细胞凋亡，并与其中芬太尼有明显的剂量依赖关系，联合应用两类药物显示出协同效应。

诱导人类细胞凋亡主要有外源性凋亡途径和内源性凋亡途径两种。外源性途径是由细胞膜表面的死亡受体触发，而内源性途径包括Bcl-2家族蛋白调节线粒体膜完整性方面的改变，以及对细胞损害或应激信号做出的潜在反应。凋亡的发生与否还有赖于Bcl-2/Bax这对抗凋亡/促凋亡蛋白之间的平衡〔11〕。Bcl-2可稳定线粒体膜，防止细胞色素C进入胞质；而Bax恰恰相反。本实验研究显示，芬太尼、5-FU在一定浓度范围内单独或联合应用均可显著下调MCF-7乳腺癌细胞Bcl-2表达、上调Bax表达，两药联合应用更显示出协同效应。这也提示两药联合应用可能是依赖线粒体途径发挥协同作用促进细胞凋亡。另外，一旦细胞受到某些凋亡信号刺激，Fas被Fas-L占据后会导致受体聚合，向Fas表达的细胞内传递死亡信号，形成死亡诱导信号复合体〔12〕。本研究结果提示联合应用两药也可能在通过死亡受体途径促进细胞凋亡上发挥协同效应。以上结果显示，两药联合应用既能在内源性途径、又能在外源性途径发挥协同作用，更有利于触发caspases级联反应引起细胞凋亡〔13〕。

参考文献4

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3王志学,孙立新,李汝泓,等.不同浓度的吗啡与5-氟尿嘧啶联合应用MCF-7乳腺癌细胞凋亡与细胞周期的影响〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(15):3223-6.

4郝振军,王志学,孙立新,等.不同浓度吗啡对5-氟尿嘧啶诱导的MCF-7乳腺癌细胞凋亡时Bcl-2、Bax表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2012；32(23):5164-6.

5王志学,孙立新,李汝泓,等.不同浓度吗啡与5-氟尿嘧啶联合应用对MCF-7乳腺癌细胞Bcl-2、Bax表达的影响〔J〕.实用医学杂志,2012；28(20):3441-3.

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8丁汉琳,张咸伟,张传汉.芬太尼影响MCF-7细胞凋亡的实验研究〔J〕.实用医学杂志,2004;20(12):1351-3.

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12Hacker G,Weber A.BH3-only proteins trigger cytochrome c release,but how〔J〕?Arch Biochem Biophys,2007;462(2):150-5.

13Rajendran RR,Kao GD."No Turning Bax" in the combined battle against prostate cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2007;13(12):3435-8.

〔2015-10-23修回〕

(编辑曲莉)

The Apoptosis in MCF-7 breast cancer cells induced by fentanyl in combination with 5-Fluouracil and the mechanism

WANG Zhi-Xue,ZHANG Xiao-Xia,LEI Yan,etal.

Department of Anesthesiology,the Affiliated Hospital of Chengde Medical College ,Chengde 067000,Hebei,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of fentanyl in combination with 5-FU on apoptosis and the regulation mechanism of the intrinsic and extrinsic pathways in MCF-7 breast cancer cells.MethodsAfter treated with different concentration of fentanyl in combination with 5-FU for 48 h,the percentage of apoptotic cells was measured by FCM through Annexin V-EGFP/ PI staining,and the expressions of Bcl-2,Bax and Fas were detected by immunocytochemistry.ResultsAfter treated with 1 μmol/L as well as 10 μmol/L of fentanyl alone,the percentage of apoptosis and expressions of Bax and Fas were increased significantly(P<0.05,P<0.01),while the expression of Bcl-2 was decreased significantly(P<0.05，P<0.01).Similarly,the apoptosis rate and expressions of Bax and Fas also were increased remarkably(P<0.01),but the expression of Bcl-2 was decreased significantly(P<0.01),when cancer cells treated with 5-FU alone. Treated with different concentration of fentanyl combined with 5-FU,the apoptosis rate and expressions of Bax and Fas were increased more remarkably than those treated with two agents alone(P<0.01),meanwhile the expression of Bcl-2 was decreased significantly(P<0.01),including that there was a synergistic effects between fentanyl and 5-FU in induction of breast cancer cell apoptosis(P<0.05，P<0.01).ConclusionsCertain concentration of fentanyl,5-FU and the combination of the two agents could promote apoptosis of MCF-7 breast cancer cells,which result from significant down-regulating expression of Bcl-2 and up-regulating expression of Bax and activation of the intrinsic pathways. Combination of fentanyl and 5-FU shows synergisms effects.

【Key words】Fentanyl;5-Fluouracil;MCF-7;Apoptosis;Bcl-2；Bax；Fas

通讯作者：刘新伟(1973-)，男，副主任医师， 主要从事麻醉药理方面的研究。

中图分类号〔〕R73-36；R34〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6705-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.026