益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠CREB、P-CREB表达的影响

尚晓玲　张家颖　公培刚　刘爱东　陆培信　胡亚男

(长春中医药大学基础医学院，吉林　长春　130117)



益肾达络饮对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠CREB、P-CREB表达的影响

尚晓玲张家颖1公培刚1刘爱东2陆培信1胡亚男

(长春中医药大学基础医学院，吉林长春130117)

摘要〔〕目的观察中药复方益肾达络饮治疗的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠中枢神经系统中cAMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平，探讨其对小鼠中枢神经损伤的可能作用机制。方法建立小鼠EAE动物模型，采用蛋白免疫印迹技术检测正常对照组、模型组、中药组、激素组、中药加激素组、抑制剂组小鼠脑和脊髓中CREB、P-CREB的表达量，并计算CREB磷酸化水平(P-CREB/CREB)。结果在脑组织中，中药组P-CREB相对表达量及CREB磷酸化水平(P-CREB/CREB)与其余各组比较均显著升高(P<0.01)；中药组、中药加+激素组和激素组CREB磷酸化水平依次降低(两两比较P<0.01)。在脊髓组织中，中药组P-CREB相对表达量均高于模型组(P<0.01)、对照组(P<0.05)和抑制剂组(P<0.05)；中药组、中药+激素组及激素组CREB磷酸化水平均高于模型组(P<0.05)，这3组之间两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论益肾达络饮对EAE的治疗作用可能与升高CREB的磷酸化水平有关。

关键词〔〕实验性自身免疫性脑脊髓炎；多发性硬化；益肾达络饮；CREB；P-CREB

1吉林大学基础医学院生物化学与分子生物学实验中心

2长春中医药大学附属医院

第一作者：尚晓玲(1975-)，女，副教授，主要从事中医藏象理论与应用研究。

多发性硬化(MS)是一种常见的中枢神经系统疾病，给患者带来巨大的身心痛苦。现有研究表明，以益肾、解毒、通络立法的中药复方益肾达络饮对MS有较好的疗效〔1〕，其治疗机制仍在探讨中。cAMP反应元件结合蛋白(CREB)是一种核转录因子，磷酸化的CREB(P-CREB)可调控下游基因表达，在神经元的发育、再生及突触形成等神经生理活动中发挥着重要作用〔2〕。本研究通过检测MS动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠脑和脊髓组织中CREB磷酸化水平，探讨MS的发病机制及其中药治疗与CREB磷酸化水平的关系，为寻找治疗MS的分子靶点提供依据。

1材料和方法

1.1实验动物SPF级8～12周龄SJL/J雌性小鼠24只，体质量18～20 g，由美国Jackson实验室提供，饲养于吉林大学实验动物中心。

1.2实验药品与试剂髓鞘蛋白脂质蛋白(PLP)139-151多肽HSLGKWLGHPDKF(纯度85%以上)购自北京赛百盛生物工程公司；百日咳杆菌购自北京生物制品研究所；完全福氏免疫佐剂(CFA)、SB203580购自美国Sigma公司；醋酸泼尼松购自天津天药药业公司；益肾达络饮由熟地、鹿角胶、栀子、生甘草、石菖蒲等组成，饮片购自长春中医药大学附属医院药房；兔抗小鼠CREB、P-CREB抗体购自Cell Signaling公司；内参蛋白兔抗小鼠Tubulin抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、BCA蛋白定量试剂盒及ECL化学发光试剂盒均购自碧云天公司。醋酸泼尼松经研钵粉碎后用无菌水溶解，配成0.039%(质量浓度)的使用液；SB203580用2%二甲基亚砜配制成1 mmol/L溶液；益肾达络饮经水煎法煎煮，过滤后收集滤液合并煎煮浓缩制成2 g生药/ml的水提物，灭菌分装。

1.3动物分组及EAE模型制备实验小鼠随机分为健康对照组(对照组)、中药组、糖皮质激素组(激素组)、中药+激素组、抑制剂组及模型组，每组4只。对照组小鼠正常饲养，其余各组按下述方法制备EAE动物模型〔3〕：将1.5 μg/μl的PLP 139-151抗原水溶液100 μl与100 μl完全福氏佐剂混合制成抗原配剂。第1天给予小鼠上腹部皮下注射200 μl抗原配剂，当天和第3天经静脉注射6.0×103/μl百日咳杆菌液100 μl。

1.4模型动物给药自造模操作后第8天始，中药组按体质量2 g生药·kg-1·d-1给予益肾达络饮0.2 ml，激素组按体质量0.078 mg·kg-1·d-1给予醋酸泼尼松0.2 ml，中药+激素组按体质量2 g生药量·kg-1·d-1及0.078 mg·kg-1·d-1醋酸泼尼松给予混合溶液0.2 ml，模型组予生理盐水0.2 ml/d，灌胃14 d，给药体积不足0.2 ml者用生理盐水补足。抑制剂组于造模第8天按体质量5 mg/kg腹腔注射SB203580〔4〕1次，此后每6 d给药1次，共给药3次。

1.5蛋白免疫印迹技术检测CREB、P-CREB表达造模后第

22天取所有组实验小鼠脑与脊髓组织，提取组织蛋白，以BCA法定量，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，一抗(兔抗小鼠CREB和P-CREB)和二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)孵育ECL化学发光法显影，应用Image J软件计算蛋白条带的灰度值(与蛋白彩色预染分子量marker比对相对分子质量，看蛋白条带的分子量是否相近)，并计算CREB与P-CREB相对表达量及CREB磷酸化水平。CREB与P-CREB两蛋白的相对表达量分别为其蛋白条带灰度与内参Tubulin条带灰度的比值，CREB磷酸化水平=P-CREB相对表达量/CREB相对表达量。

2结果

脑组织中P-CREB相对表达量，中药组与其余各组比较均显著升高(P<0.01)，抑制剂组与激素组和模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)，中药+激素组与对照组、模型组和抑制剂组比较差异无统计学意义(P>0.05)；脊髓组织中P-CREB相对表达量中药组高于模型组(P<0.01)、对照组(P<0.05)和抑制剂组(P<0.05)，激素组高于模型组(P<0.05)和抑制剂组(P<0.05)，中药组、激素组及中药+激素组两两比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1，图1。

A：对照组：B：中药组；C：激素组；D：中药+激素组；E：模型组；F：抑制剂组图1　各组脑与脊髓组织CREB、P-CREB相对表达比较

组别脑组织P-CREBCREBP-CREB/CREB脊髓组织P-CREBCREBP-CREB/CREB抑制剂组0.562±0.672)8)0.979±0.062)4)6)8)10)0.576±0.083)8)10)0.366±0.136)8)10)0.370±0.022)4)5)7)0.986±0.374)中药+激素组0.445±0.108)0.299±0.022)4)6)1.482±0.272)3)6)8)0.556±0.176)8)0.516±0.021)4)1.073±0.294)中药组0.801±0.082)4)6)10)0.244±0.032)4)6)3.301±0.362)4)6)10)0.769±0.191)4)6)10)0.902±0.042)3)0.849±0.183)激素组0.550±0.082)0.721±0.032)4)8)10)0.762±0.108)0.695±0.283)8)10)0.821±0.022)4)0.842±0.323)模型组0.575±0.092)0.586±0.062)6)8)10)0.982±0.138)9)0.297±0.106)7)10)0.945±0.012)5)7)0.313±0.111)5)7)10)对照组0.346±0.046)0.433±0.056)8)10)0.806±0.128)10)0.417±0.096)8)0.464±0.027)0.896±0.17

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与激素组比较：5)P<0.05,6)P<0.01；与中药组比较:7)P<0.05,8)P<0.01;与中药+激素组比较：9)P<0.05,10)P<0.01

脑组织CREB磷酸化水平(P-CREB/CREB)中药组与其余各组相比均升高(P<0.01)；激素组较对照组、模型组和抑制剂组差异均无统计学意义(P>0.05)，中药+激素组高于对照组(P<0.01)、激素组(P<0.01)、模型组(P<0.05)和抑制剂组(P<0.01)；中药组、中药+激素组和激素组的CREB磷酸化水平依次降低(两两比较均P<0.01)。脊髓组织CREB磷酸化水平中药组、中药+激素组及激素组均高于模型组(P<0.05)，三组间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

3讨论

MS是一种累及中枢神经系统的自身免疫性疾病，其病变分布广泛，可累及大脑、脑干、脊髓、视神经等处。 EAE是研究MS的经典动物模型，MS/EAE病理特点为中枢神经系统多发的白质炎性反应、脱髓鞘和胶质斑块形成〔5〕。众多研究表明，CREB在神经元的发育、再生、突触形成等神经生理活动中发挥着重要作用，揭示其在MS/EAE病理机制中可能起了不可忽视的作用。北京中医药大学高颖教授的研究团队创立了以益肾、解毒、通络立法的中药复方益肾达络饮，临床观察表明对MS有较好的疗效〔6，7〕。我研究团队经过多年研究已证实其治疗MS/EAE机制体现在降低炎性反应、减轻轴索损伤、影响信号通路等方面，但是其治疗的信号通路机制还未完全弄清楚。

CREB的活化是靠自身磷酸化来介导的，尤其是133位丝氨酸的磷酸化。P-CREB可以与含有cAMP反应元件结构的基因启动子区结合，参与调节下游基因(如神经生长因子、脑源性神经营养因子、血管内皮生长因子等)的转录〔8〕。在中枢神经系统中，CREB调节神经细胞的生长发育，参与神经细胞突触可塑性和长时程记忆的形成过程。CREB是许多胞内激酶的底物，其活化的通路主要有通过cAMP的蛋白激酶A激活途径、通过Ca2+的钙调蛋白依赖性激酶激活途径、通过生长因子受体的蛋白激酶B激活途径等〔9〕。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在CREB的磷酸化过程中也发挥着重要作用，该通路可参与细胞生长、增殖和凋亡等生理过程，并影响神经突触可塑性〔10〕，其中p38 MAPK通路与炎性反应、应激反应的调控密切相关。

SB203580是一种p38抑制剂，能够特异性抑制p38活性，阻断p38 MAPK信号通路向核内传递，一定程度上可以阻止CREB磷酸化。既往研究表明，SB203580能够明显降低EAE小鼠的神经功能，而益肾达络饮治疗EAE的药理机制与调节p38 MAPK通路密切相关〔6〕。醋酸泼尼松是目前临床治疗MS的常用激素，具有抗炎和免疫抑制作用。本实验结果提示益肾达络饮可明显促进脑CREB的磷酸化，且效果优于醋酸泼尼松。益肾达络饮与醋酸泼尼松联合用药后，CREB的磷酸化水平并没有表现出累积升高的趋势。临床上中药和激素联合用药治疗MS时，大多采用中药药量不变、激素缓慢减量的给药方式，治疗前期大剂量激素旨在控制病情，达到治疗效果后给药量逐渐减少直至停止激素给药，而不是一直高剂量激素用药，这一有效的治疗方案也从另一侧面印证了联合用药组CREB磷酸化水平不高于中药组这一结果的合理性。

越来越多的研究表明，CREB在神经元的发育、再生、突触形成等神经生理活动中发挥着重要作用〔2〕；许多神经功能障碍疾病如阿尔茨海默病〔11〕、癫痫、痴呆、抑郁症等都与胞内CREB的磷酸化有关。但是关于MS发病过程中CREB、P-CREB蛋白的表达研究非常鲜见，通过上述结果我们确定EAE与CREB磷酸化水平相关，EAE模型小鼠经中药复方益肾达络饮治疗后，脑和脊髓中P-CREB相对表达量及CREB磷酸化水平均显著升高，前面提到益肾达络饮促进脑CREB的磷酸化效果优要于激素组，这都表明中药治疗MS可能与CREB的磷酸化水平升高有关，推测CREB有可能可以作为研究和治疗MS的目标分子。

参考文献4

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10卢峻，杨秀岩，华茜.cAMP反应元件结合蛋白：抗抑郁药信号转导通路的交汇点〔J〕.生理科学进展，2008；39(1)：371-4.

11张葳蕤，刘丽君，高茂隆.高表达GPX1对阿尔兹海默病细胞模型内P-CREB水平的影响〔J〕.中国神经免疫学和神经病学杂志，2012；19(2)：366-70.

〔2015-01-17修回〕

(编辑李相军)

Effects of Yishendaluo decoction on expressions of CREB and P-CREB in experimental autoimmune encephalomyelitis mice

SHANG Xiao-Ling, ZHANG Jia-Ying, GONG Pei-Gang,etal.

Department of Basic Theory of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，Jilin, China

【Abstract】ObjectiveTo Investigate the phosphorylation level of CREB (cAMP response element-binding protein) in central nervous system of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice, in order to explore the mechanism of Yishendaluo decoction on the therapy of central nervous system injury.MethodsEAE mice models were established, and different interference therapies were treated with Yishendaluo decoction-treated, hormone-treated, Yishendaluo decoction-hormone treated and inhibitor-treated groups，every group had four mice. Western blot was used to determine the expressions of CREB and P-CREB proteins in brain and spinal cord tissue of the EAE mice.ResultsIn mice brain tissue, the expression of P-CREB/CREB in Yishendaluo decoction-treated group was higher than that of other groups (all P<0.01); the phosphorylation level of CREB was declining in Yishendaluo decoction-treated, Yishendaluo decoction-hormone treated and only hormone-treated groups(all P>0.05). In spinal cord tissue, the level of P-CREB protein in Yishendaluo decoction-treated group was higher than that of model group (P<0.01), normal group (P<0.05) and SB203580-treated group (P<0.05); The phosphorylation levels of CREB in Yishendaluo decoction-treated, Yishendaluo decoction-hormone treated and only hormone-treated groups were higher than those of model group (P<0.05), but there′s no significant difference among these three groups (all P>0.05).ConclusionsTo a certain extent, the mechanism of Yishendaluo decoction on EAE mice might be associated with the phosphorylation level of CREB.

【Key words】Experimental autoimmune encephalomyelitis；Multiple sclerosis；Yishendaluo decoction；CREB；P-CREB

通讯作者：胡亚男(1978-)，女，在读博士，讲师，主要从事神经脑病学研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(30901893)；吉林省科技厅自然科学基金资助项目(201215158)

中图分类号〔〕R744.5+1〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6677-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.015