大鼠肢体缺血/再灌注后心肌细胞凋亡及氧化应激的调节作用

朱　娜　要瑞莉　刘俊双　马俊利

(唐山职业技术学院基础医学部，河北　唐山　063000)



大鼠肢体缺血/再灌注后心肌细胞凋亡及氧化应激的调节作用

朱娜要瑞莉刘俊双1马俊利

(唐山职业技术学院基础医学部，河北唐山063000)

摘要〔〕目的观察大鼠肢体缺血/再灌注(I/R)后心肌细胞凋亡及Bcl-2/Bax表达的变化和氧化应激的调节作用。方法健康雄性Wistar大鼠30只，随机分成对照组、肢体I/R 2 h组(I/R 2 h组)和4 h组(I/R 4 h组)。免疫组化法检测心肌组织Bcl-2/Bax蛋白表达；原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记(TUNEL)技术检测心肌凋亡细胞；生化法检测血浆心肌酶含量；比色法测定心肌组织活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的变化。结果肢体I/R后与对照组比较，血浆心肌酶含量升高；心肌组织ROS和MDA含量增加，SOD活性降低(P<0.05)；心肌凋亡细胞明显增加(P<0.01)；心肌组织Bcl-2与Bax表达增强，但Bax表达较Bcl-2明显上调，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)；相关分析显示，ROS含量与Bax蛋白表达平均吸光度值和凋亡指数(AI)之间呈显著正相关(P<0.01)。结论大鼠肢体I/R后可致心肌细胞凋亡；心肌细胞凋亡与Bcl-2/Bax蛋白表达比值降低和心肌氧化应激增强有关。

关键词〔〕缺血/再灌注；心肌；凋亡；Bcl-2；Bax；氧化应激

1中国人民解放军第255医院心内科

第一作者：朱娜(1977-)，女，硕士，讲师，主治医师，主要从事肢体缺血再灌注损伤的防治及机制研究。

研究表明，严重的肢体缺血/再灌注(I/R)后可致心肌组织损伤〔1〕。临床和实验证实，凋亡存在于各种心脏损伤的相关疾病过程中〔2，3〕，并对其发生发展产生重要影响。氧化应激是诱导心肌细胞凋亡的一个主要机制〔4〕，但目前对于氧化应激通过何种机制介导心肌细胞凋亡仍不十分清楚。本实验旨在研究大鼠肢体I/R后心肌细胞凋亡及Bcl-2/Bax的调节作用和氧化应激的影响。

1材料与方法

1.1主要药品活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购于南京建成生物工程研究所，TUNEL试剂盒、Bcl-2、Bax多克隆抗体、即用型免疫组化试剂盒购于北京中山生物技术公司。

1.2动物分组及模型制备健康雄性Wistar大鼠(280±20)g随机分为三组，每组10只，术前喂养14 d。对照组：常规饲养，双后肢松弛环绕橡皮圈，不阻断血流，其余操作同肢体I/R组。肢体I/R分为I/R 2 h和I/R 4 h组，按照文献〔5〕建立大鼠肢体I/R模型。用橡皮圈环绕结扎大鼠双后肢根部，阻断4 h后松解，恢复血流灌注2 h和4 h后分别自大鼠腹主动脉取血处死动物，即刻开胸取出心脏，于心尖部横断切取长约0.5 cm的心肌组织放入中性甲醛固定，其余组织放入液氮-70℃保存。

1.3测定指标

1.3.1血浆心肌酶含量的测定从腹主动脉放血处死动物并收集血液，取抗凝血离心后分离血浆，用HI-TACHI7200全自动生化分析仪测定肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量。

1.3.2心肌组织ROS、MDA和SOD含量的测定取心肌组织200 mg，放入装有2 ml冷生理盐水制成匀浆，于低温下经3 500 r/min离心15 min，收集上清液，根据化学比色法分别测定ROS、MDA和SOD的含量。

1.3.3心肌细胞凋亡的原位检测检测方法严格按说明书操作。阴性实验对照：经固定和消化的样品中加入不含末端脱氧核糖核酸转移酶的标记溶液代替TUNEL反应混合液。细胞核呈棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞，计算6个高倍视野(×400)下的凋亡细胞数，凋亡指数(AI)以凋亡细胞/100个细胞表示。

1.3.4心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达测定取心尖部心室肌组织，多聚甲醛固定石蜡包埋切片，按免疫组化常规操作。以0.01 mol/L PBS代替一抗为阴性对照。细胞质呈棕黄色染色者为阳性细胞。采用Motic医学图像分析系统软件对各组大鼠心肌组织切片进行分析，镜下以相同外部条件摄取图像(×200)，每张随机选择6个视野，得出阳性目标平均光密度值，每张切片取平均值。

1.4统计学分析采用SPSS13.0统计软件，行方差分析、q检验，相关分析采用Pearson相关分析法。

2结果

2.1各组血浆CK、CK-MB含量的变化肢体I/R 2 h组与对照组比较，血浆CK和CK-MB含量分别升高了61.1%和128.6%(P<0.01)；肢体I/R 4 h组与对照组比较，血浆CK和CK-MB含量进一步升高，分别升高144.4%和246.4%(P<0.01)，见表1。

组别CK(μmol/L)CK-MB(μmol/L)对照组0.36±0.090.28±0.11I/R2h组0.58±0.081)0.64±0.101)I/R4h组0.88±0.101)0.97±0.101)

与对照组比较：1)P<0.01

2.2各组动物心肌组织ROS、MDA、SOD含量变化肢体I/R 2 h组与对照组比较，心肌组织ROS和MDA含量分别升高了24.2%和25.7%(P<0.05)，SOD含量降低了12.4%(P<0.05)；肢体I/R 4 h组与对照组比较，心肌组织ROS和MDA含量分别升高了77.9%和48.3%(P<0.01)，SOD含量降低了21.6%(P<0.01)，见表2。

组别ROS(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)对照组34.26±1.329.49±2.9171.55±6.21I/R2h组42.54±1.481)11.92±1.481)63.66±3.721)I/R4h组60.94±2.102)14.07±2.482)56.82±4.832)

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

2.3各组心肌凋亡细胞的变化TUNEL染色可见阳性细胞核呈棕黄色，形状不规整；肢体I/R 2 h组与对照组比较，心肌组织可见凋亡细胞增多，AI升高，但无差异显著性。肢体I/R 4 h组与对照组比较，心肌组织可见凋亡细胞显著增多，AI升高(P<0.01)，见表3，图1。

2.4心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达的检测Bcl-2和Bax主要存在于心肌细胞、血管内皮细胞，阳性细胞胞质或胞膜呈棕黄色颗粒或匀质状。对照组呈弱阳性表达，肢体I/R 2 h组与对照组比较，Bcl-2表达未见明显变化，Bax表达上调，肢体I/R 4 h组与对照组比较，Bcl-2和Bax表达均明显上调，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)，见图2、图3、表3。

2.5相关分析结果肢体I/R组心肌组织中ROS含量与Bax蛋白表达平均吸光度值和AI之间呈显著正相关(r=0.746，P<0.01；r=0.643，P<0.01)。

组别AI(%)Bcl-2BaxBcl-2/Bax对照组2.53±1.070.120±0.0070.112±0.0091.080±0.116I/R2h组4.45±1.670.126±0.0090.132±0.0121)0.955±0.0671)I/R4h组16.59±2.592)0.160±0.0082)0.172±0.0102)0.935±0.0512)

图1　TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞的凋亡形态学改变(×400)

图2　免疫组化法检测各组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白表达(DAB，×200)

图3　免疫组化法检测各组大鼠心肌组织Bax蛋白表达(DAB，×200)

3讨论

严重的肢体I/R不仅局部经历缺血再灌注损伤，甚至可导致远隔器官心肌的损伤〔1〕。本实验结果显示，随再灌时间延长，大鼠血浆心肌酶CK、CK-MB漏出增多。CK和CK-MB是催化心肌细胞代谢的重要酶类物质，是检测心肌损伤的特异性指标。随着再灌注时间延长，心肌酶泄露增多，预示心肌发生了损伤。为证实再灌注心肌发生了何种损伤，本实验结果提示细胞凋亡存在于LI/R后心肌损伤过程中。

研究证实ROS是诱导多种心血管疾病发生的重要机制，介导整个损伤过程〔6〕。ROS对细胞的主要损伤是造成脂质过氧化，其代谢产物为MDA，间接反映组织细胞受ROS损伤的严重程度。SOD是体内主要的氧自由基清除酶，其活性强弱反映自由基清除水平。ROS的过量生成和(或)细胞内抗氧化防御系统受损，导致ROS及其相关代谢产物过量聚集而引起的氧化应激状态，是肢体I/R后致远隔器官损伤的主要机制。本实验结果显示，大鼠肢体在恢复血流供给后，心肌组织ROS大量产生，自由基清除酶SOD含量降低，脂质过氧化物MDA水平明显增高，证实心肌处于氧化应激状态。Cook等〔7〕首先研究发现H2O2或O2·等外源性ROS可诱导培养的乳鼠心肌细胞凋亡。研究表明，众多上游应激信号，包括氧化应激、炎症反应等与心肌细胞凋亡信号有明显的交联〔8〕。本实验发现，ROS增加与心肌组织细胞凋亡的增加相一致，说明ROS是参与细胞凋亡的重要因素之一。细胞凋亡是细胞主动死亡的一种形式，主要受细胞内凋亡调控蛋白的影响，促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白间失衡所致。Bcl-2家族蛋白在调节细胞凋亡过程中起重要作用，Bcl-2是抑制细胞凋亡的基因，而Bax为Bcl-2的同源体，抑制Bcl-2作用，促进细胞凋亡〔9，10〕。Bcl-2与Bax可以结合成杂二聚体，两者比率决定细胞凋亡的敏感性，当Bcl-2/Bax增加，抑制细胞凋亡，Bcl-2/Bax降低，促进细胞凋亡〔11〕。本研究表明Bcl-2和Bax表达的变化可能参与肢体I/R后心肌损伤，胞内Bcl-2/Bax比值是影响心肌凋亡的重要因素之一。直线相关分析提示ROS增加可能通过Bcl-2/Bax信号途径参与了心肌凋亡，氧化应激源性激活的Bcl-2/Bax信号途径在心肌损伤致心肌细胞凋亡中发挥重要作用。

参考文献4

1赵利军，门秀丽，董淑云，等.L-精氨酸对大鼠肢体缺血/再灌注后心肌损伤的影响〔J〕.中国药理学通报，2008；24(6)：827-30.

2Lee Y，Gustafsson AB.Role of apoptosis in cardiovascular disease〔J〕.Apoptosis，2009；14(4)：536-48.

3Singh SS，Kang PM.Mechanisms and inhibitors of apoptosis in cardiovascular diseases〔J〕.Curr Pharm Des，2011；17(8)：1783-93.

4滕旭，齐永芬，唐朝枢.内质网应激与心脏疾病〔J〕.生理科学进展，2009；40(2)：106-10.

5张连元，杨林.生理科学实验教程〔M〕.北京：人民军医出版社，2001：29.

6Sugamura K，Keaney JF.Reactive oxygen species in cardiovascular disease〔J〕.Free Radic Biol Med，2011；51(5)：978-92.

7Cook SA，Sugden PH，Clerk A.Regulation of Bcl-2 family proteins during development and in response to oxidative stress in cardiac myocytes：association with changes in mitochondrial membrance potential 〔J〕.Circ Res，1999；85(10)：940-9.

8Blum A.Heart failure-new insights〔J〕.Isr Med Assoc J，2009；11(2)：105-11.

9Antonsson B，Conti F，Ciavatta A，etal.Inhibition of bax channel forming activity by bcl-2〔J〕.Science，1997；277(5324)：370.

10董雅洁，高维娟.Bcl-2、bax、caspase-3在细胞凋亡中的作用及其关系 〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(21)：4828-30.

11Ei-Donmyati M，Barakat M，Abdei-Razek R，etal.Apoptosis，P53 and Bcl-2 expression in response to topical calcipotriol therapy for psoriasis〔J〕.Int J Dematol，2007；46(5)：467-74.

〔2014-09-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

基金项目：唐山市科学技术研究与发展项目(No.12130239b)

中图分类号〔〕R363.2〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6666-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.010