吡那地尔后处理大鼠缺血再灌注损伤心肌线粒体的蛋白质组学研究*

魏义勇，　李　科，　刘　云，　刘兴奎，　王海英，　喻　田

(遵义医学院附属医院麻醉科， 贵州 遵义 563003)



吡那地尔后处理大鼠缺血再灌注损伤心肌线粒体的蛋白质组学研究*

魏义勇，李科，刘云，刘兴奎，王海英，喻田△

(遵义医学院附属医院麻醉科， 贵州 遵义 563003)

[摘要]目的： 运用蛋白质组学研究方法探讨吡那地尔后处理对缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用。方法: 建立Langendorff大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型，随机分为吡那地尔后处理组(Pina组)和缺血再灌注损伤组(I/R组)，每组9只。提取心肌线粒体蛋白质行双向凝胶电泳，应用质谱鉴定差异大于2倍的蛋白质点。结果: Pina组与I/R组比较，共发现7个差异蛋白质：Pina组NADH脱氢酶1α亚复合体10亚基(NDUFA10)﹑NADH脱氢酶铁硫蛋白2(NDUFS2)和NADH脱氢酶黄素蛋白2(NDUFV2)表达低于I/R组；Pina组异柠檬酸脱氢酶α亚基(IDHA)和Δ3,5-Δ2,4-二烯酰辅酶A异构酶(ECH1)表达高于I/R组；另有2个蛋白质点均被鉴定为ATP合酶δ亚基，一个蛋白质点表达升高，而另一个表达降低。结论:吡那地尔后处理可能抑制了复合体Ⅰ的亚基(NDUFA10﹑NDUFS2和NDUFV2)代偿性增加，但促进了IDHA和ECH1表达并引发了ATP合酶δ亚基发生磷酸化，这些改变可能均与吡那地尔后处理保护心肌的作用有关。

[关键词]吡那地尔； 缺血再灌注损伤； 线粒体； 蛋白质组学； 后处理

吡那地尔(pinacidil，Pina)是一种非选择性线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP)开放剂，其后处理能产生确切的心肌保护效应[1-2]。研究表明mitoKATP开放可能是后处理心肌保护作用机制的触发点和终末效应器[3]，但具体机制仍不十分清楚。本研究拟通过分析吡那地尔后处理对缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤大鼠心肌线粒体蛋白质表达的影响，进一步探讨吡那地尔后处理的心肌保护作用机制。

材料和方法

1材料

1.1动物选择和分组健康雄性清洁级SD大鼠，体重250～300 g，4～5月龄[由第三军医大学提供，动物证书号为SCXK(渝)2007-0005]。将动物随机分成2组：吡那地尔后处理组(Pina组)和缺血再灌注损伤组(I/R组)。

1.2主要试剂吡那地尔；Nycodenz密度梯度介质；灌注液为K-H液(mmol/L)：NaCl 118.00、KCl 4.75、CaCl22.50、NaHCO324.80、MgCl2·6H2O 1.19、KH2PO41.19和glucose 11.1;线粒体分离介质1×MS(210 mmol/L mannitol、70 mmol/L sucrose、5 mmol/L Tris-HCl和1 mmol/L EDTA，pH 7.4);裂解液(7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4% CHAPS、5 mmol/L EGTA和65 mmol/L DTT，pH 7.4)，以上试剂均购自Sigma。BCA蛋白浓度测定试剂盒由江苏碧云天生物技术研究所提供，RCDC蛋白质定量试剂盒由Bio-Rad提供。

2方法

2.1建立模型腹腔注射异戊巴比妥钠(40 mg/kg)后迅速沿剑突下打开胸腔，于主动脉根部剪下心脏，放入K-H液中，迅速将主动脉固定于Langendorff灌注管口，每组均灌注氧合的K-H液20 min，常温下缺血40 min后，Pina组续灌初给予吡那地尔(50 μmol/L)2 min，续灌37 ℃含氧K-H液58 min,I/R组续灌37 ℃含氧K-H液60 min。参照文献建立Langendorff离体大鼠心脏缺血再灌注损伤模型[4]，比较灌注20 min和续灌60 min时2组左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)及左室发展压(left ventricular developed pressure，LVDP)的差异。

2.2线粒体蛋白质提取离体灌注后, 迅速取出心脏，浸入线粒体分离介质中冰浴匀浆。4 ℃ 1 500×g离心10 min，取上清液4 ℃ 15 000×g离心10 min，沉淀即为粗提线粒体。粗提线粒体加入Nycodenz密度梯度介质中，4 ℃ 100 000×g离心60 min,即得到纯化线粒体。向纯化线粒体中加入10倍体积的裂解液冰上孵育20 min, 超声破碎3 min 后, 4 ℃ 20 000×g离心30 min，上清即为线粒体蛋白。Bio-Rad公司的RC DC试剂盒方法行蛋白定量检测，350 μg分装，-80 ℃保存。

2.3双向凝胶电泳及质谱分析根据Bio-Rad公司的操作手册优化双向电泳过程，每组同时运行3个蛋白质样品, 每个样品重复3次。第一向等电聚焦电泳和第二向SDS-PAGE后，凝胶行硝酸银染色。染色后的凝胶用EPSON Scan 2.2扫描仪透射扫描获取图像，PDQuest 8.0软件分析比较2组间蛋白质点的差异, 表达量改变(上调或下调) 2倍以上认为有差异。切取差异蛋白质点胶粒行胶内酶解,运用MALDI-TOF-MS分析，获得的肽质量指纹图谱(PMF)通过Mascot软件检索蛋白质数据库。同时, 对二级串联质谱的肽序列信息进行检索, 进一步确证鉴定结果，选取部分差异蛋白质用Western blot法行回复验证。

3统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，使用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用t检验以及单因素方差分析进行组间差异比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1心功能的变化

灌注20 min，2组中LVEDP和LVDP均未发生明显变化，续灌60 min，Pina组LVEDP低于I/R组(P<0.05)，而LVDP高于I/R组(P<0.05)，见表1。

表12组离体心脏左室心功能的变化

Table 1.The changes of left ventricular functions in the 2 groups (mmHg. Mean±SD.n=8)

GroupPerfusionfor20minReperfusionfor60minLVEDPLVDPLVEDPLVDPPina3.56±0.74122.40±8.707.87±1.21*87.66±6.21*I/R4.04±0.89115.70±6.8821.81±2.4756.81±7.40

*P<0.05vsI/R group.

2双向凝胶电泳

经蛋白质点的检测、背景扣除、量化和匹配后，每张凝胶上检测出(480±22)个蛋白质点，PDQuest 8.0软件分析后得到7个差异蛋白质点(图1)，结果显示，Pina组与I/R组比较，共发现7个差异蛋白质：Pina组NADH脱氢酶1α亚复合体10亚基(NDUFA10)﹑NADH脱氢酶铁硫蛋白2(NDUFS2)和NADH脱氢酶黄素蛋白2(NDUFV2)表达低于I/R组；Pina组异柠檬酸脱氢酶α亚基(IDHA)和Δ3,5-Δ2,4-二烯酰辅酶A异构酶(ECH1)表达高于I/R组；另有2个蛋白质点均被鉴定为ATP合酶δ亚基，一个蛋白质点表达升高，而另一个表达降低。这些蛋白质点经MALDI-TOF-MS鉴定结果及丰度变化见图2、表2。

Figure 1.The maps of two-dimensional electrophoresis in the 2 groups.

图1Pina组与I/R组的凝胶图像比较软件分析后的差异蛋白质点

Figure 2.The changes of differential protein abundance in the 2 groups.

图2Pina组与I/R组比较差异蛋白点的丰度变化

表2　2组差异蛋白质数据检索结果

3回复验证

Pina组NDUFA10和NDUFS2的表达均低于I/R组(P<0.05)，见图3。此结果与双向凝胶电泳的改变趋势一致，证明本实验结果可靠。

Figure 3.The expression of NDUFA10 and NDUFS2 proteins in each group detected by Western blotting. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsI/R group.

图3NDUFA10和NDUFS2在各组表达的免疫印迹分析

讨论

本研究证实吡那地尔后处理明显改善了缺血鼠心功能，与既往的研究结果一致[4]。通过蛋白质组学研究方法比较了吡那地尔后处理与心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌线粒体蛋白质的表达图谱，对7个差异蛋白质进行了鉴定，发现这些蛋白质均与能量代谢和线粒体呼吸链有关，具体分述如下。

本实验发现Pina组复合体Ⅰ的亚基(NDUFA10﹑NDUFS2和NDUFV2)表达较I/R组低，推测可能是吡那地尔后处理的离体心脏，mitoKATP开放，K+进入线粒体内，激活线粒体NADH呼吸链，ROS生成减少，ATP生成增加[5]，H+-K+交换和H+-Na+交换加快，细胞内和线粒体内酸中毒改善，机体所需的代偿减少，使得这3个蛋白质的表达增加程度降低。Kim等[6]通过兔心肌缺血预处理线粒体蛋白质组学研究发现，缺血预处理组NDUFA10和NDUFS2的表达较缺血再灌注损伤组低，并认为这种变化可能是作为代偿措施来保护线粒体功能。有文献报道NDUFS的亚基可能是治疗心肌缺血再灌注损伤的靶点[7]，且NDUFV2可能是肥厚型心肌病损害的靶蛋白[8]。本实验发现吡那地尔后处理导致复合体Ⅰ的3个亚基存在着相似的变化，而研究表明mitoKATP开放可能是预处理和后处理心肌保护作用的触发点和终末效应器[2]，因此，这3个蛋白质的改变可能与mitoKATP开放心肌保护作用的机制有着紧密联系。

IDHA和ECH1在线粒体呼吸链和能量代谢过程中起着重要作用，目前它们在心肌保护方面的文献报道较少。本研究发现这2个蛋白质的表达在Pina组均高于I/R组，推测可能是吡那地尔后处理促进了它们的表达，以维持线粒体电子传递和能量代谢的正常功能。

研究表明，ATP合酶在预处理和mitoKATP开放心肌保护机制中均起着重要作用[9]。本研究发现有2个蛋白质点经鉴定均为ATP合酶d亚基，一个蛋白质点表达上调，而一个表达下调。推测可能是吡那地尔后处理致该蛋白质发生了磷酸化，且这种修饰在mitoKATP开放心肌保护作用机制中扮演着重要角色。学者通过腺苷和二氮嗪预处理心肌线粒体蛋白质组学研究发现ATP合酶的亚基发生了磷酸化，并证实ATP合酶的亚基磷酸化能起到心肌保护作用[10]。文献显示，ATP合酶的亚基发生磷酸化可能与mitoKATP开放的心肌保护作用机制有关[11-12]。

综上所述，本研究证实吡那地尔后处理可能引起了复合体Ⅰ的亚基(NDUFA10﹑NDUFS2和NDUFV2)代偿性增加程度降低，促进了IDHA和ECH1表达升高，引发了ATP合酶δ亚基发生磷酸化。这些改变可能均参与了吡那地尔后处理心肌保护作用的机制，且这几个蛋白质极可能是mitoKATP开放心肌保护作用的关键蛋白质，对其深入研究有益于进一步揭示吡那地尔后处理的心肌保护作用机制。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81460462; No. 31460696；No. 31001128)；南昌大学研究生创新基金资助项目(No. cx2015170)

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No. 81170177, No. 81030002)

·综述·

Proteomic study of myocardial mitochondria with ischemia/reperfusion injury and pinacidil postconditioning in isolated rat heartsWEI Yi-yong, LI Ke, LIU Yun, LIU Xing-kui, WANG Hai-ying, YU Tian

(DepartmentofAnesthesiology,TheAffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:zyyutian@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effect of pinacidil postconditioning on rat myocardium suffering ischemia/reperfusion injury by mitochondrial proteomics. METHODS: Langendorff apparatus was used to establish the model of myocardial ischemia/reperfusion injury. Sprague-Dawley rats were randomly divided into 2 groups: pinacidil postconditioning group (Pina group) and ischemia/reperfusion injury group (I/R group). After 20 min of perfusion with K-H solution, the perfusion was suspended for 40-min (global ischemia) follow by 60 min of reperfusion in I/R group. In Pina group at the end of 40 min global ischemia, the isolated hearts were perfused with K-H solution containing pinacidil (50 μmol/L) for 2 min followed 58-min perfusion with regular K-H solution. Total proteins extracted from the mitochondria were applied to the two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). The differentially expressed protein spots over 2 times were evaluated by a software. Then they were subjected to in-gel digestion, and analyzed by spectrometry. RESULTS: The expression levels of NDUFA10, NDUFS2 and NDUFV2 were elevated but those of IDHA and ECH1 were decreased in Pina group compared with I/R group. Interestingly, 2 spots in the 2-DE map were identified as ATPase subunit δ. The expression levels of one spot was elevated, while the other was decreased. CONCLUSION: Pinacidil postconditioning may decrease the degree of increased expression levels of NDUFA10, NDUFS2 and NDUFV2, promote the expression of IDHA and ECH1, and induce the phosphorylation of ATPase subunit δ, which may be related to the protective mechanism of pinacidil postconditioning.

[KEY WORDS]Pinacidil; Ischemia/reperfusion injury; Mitochondria; Proteomics; Postconditioning

通讯作者△余琼芳 Tel： 0791-86259017； E-mail： qiongfangyu@yeah.net； 高典 Tel： 0791-86360556; E-mail： gaodian@ncu.edu.cn △Tel: 010-66936762; E-mail: liyangbsh@163.com

[收稿日期]2015- 09- 18[修回日期] 2015- 10- 14 2015- 07- 07[修回日期] 2015- 10- 13

[文章编号]1000- 4718(2015)12- 2296- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.030

[中图分类号]R363

[文献标志码]A