ZFN,TALEN,CRISPR/Cas9和NgAgo/gDNA四代基因编辑系统及其在农业和林业上的应用展望

赵华东漯河医学高等专科学校

ZFN,TALEN,CRISPR/Cas9和NgAgo/gDNA四代基因编辑系统及其在农业和林业上的应用展望

赵华东
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基因编辑技术是当前生命科学和医学的科学前沿，本文力求用最浅显语言讲述基因编辑技术及四代[1-4]基因编辑系统。文后列举课题，以咨参考。

基因编辑；技术

在今年的5月2日，科学家韩春雨与合作者在《自然·生物技术》发表的一篇论文[5]，标志着一种名为NgAgo-gDNA的基因编辑系统的诞生。有人称NgAgo-gDNA系统为第四代基因编辑系统。接下来我们就看一看四代基因编辑系统的来龙去脉。

1 从分子水平上改变生物体性状的技术

生命体的形态结构和生理特征，如ABO血型，都称为性状。性状都是由基因决定的，基因的成分就是DNA。我们编辑基因就能改变生物体外在的性状，这就是基因编辑。通过基因组编辑技术能实现三种目的：基因敲除、特异突变和定点转基因。

2 所有基因编辑系统的一般作用模式

不论是第一代锌指核酸内切酶（ZFN）系统[1]和第二代类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）系统[2]，还是第三代CRⅠSPR∕Cas9系统[3,4]，还有被称为第四代的NgAgo-gDNA系统[5]都有相通的一般作用模式：

（1）这些系统都有一个特异性“抓手”，用以识别和抓住目标基因的特异性DNA序列：①ZFN系统的抓手由锌指蛋白充当；②TALEN系统的抓手是激活因子样效应物；③对于CRⅠSPR∕Cas9系统来说，抓手是一段单链RNA序列；④NgAgo-gDNA系统的抓手是一段5’端磷酸化的单链DNA。

（2）这些系统都有剪切DNA的“剪刀”：①第一代的剪刀是非特异性核酸内切酶；②第二代的剪刀是切断DNA双链的核酸酶；③第三代的剪刀是Cas9；④而NgAgo-gDNA系统的剪刀是NgAgo，适合在人体细胞中进行基因组编辑。

（3）目标的达成都依赖生物体的DNA损伤修复的应答机制。

3 四代基因编辑系统的比较

第一代ZFN系统[1]，技术上较难，①需高投入设计ZFN；②过量ZFN对细胞有损伤；③精确程度和后果较难预料；④ZFN的脱靶切割会导致细胞毒性，在基因治疗的领域出现了应用局限。

第二代TALEN系统[2]，技术上较易，①可设计性强，不受上下游序列影响；②与基因组的特异性结合受邻近序列的影响；③仍有一定细胞毒性，模块组装过程繁琐。

第三代CRⅠSPR∕Cas9系统[3,4]，技术上容易，①天然存在的系统，识别的精度高；②更为简单和廉价，具有效率性和简易性；③降低了脱靶几率，减低了细胞毒性；④Cas9基因组的靶点选择受到PAM区和富含GC区的限制；⑤RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或者脱靶效应。

第四代NgAgo-gDNA系统[5]，较之以前更为先进，技术优势明显，①向导设计制作简便，无需构建表达载体；②对基因组任何位置都能有效引入双链断裂；③由于向导核酸是DNA，大幅降低了失效和脱靶率，对游离于细胞核的DNA具有更高的切割效率；④NgAgo结合24个碱基的gDNA，这比Cas9的gRNA19个碱基要长5个碱基，理论上其精确性要提高1024倍；⑤已经证实NgAgogDNA能够对哺乳动物基因组进行高效地编辑；⑥可用于微生物、植物和动物的精准基因改造，在多方面具有重要应用价值。

4 基因编辑在农业和林业上亟待解决的重大课题举例

例1：有“行道树之王”之称的乔木——悬铃木，极大地改善了城市的生态环境，是一种非常优良的绿化树种。但是悬铃木有两个比较突出的缺点——其一是球果飞絮，其二是花粉过敏，这些几乎成了城市公害[6,7,8]。如果筛选出产生球果的关键基因，用基因编辑技术给予基因敲除，培育出不产生球果和花粉的悬铃木，就能够极大地造福社会。

例2：杨树给人们带了可观的经济效益和环境效益。但是杨树一个很大的缺点[9,10]——产生了大量的杨絮，污染空气，造成了粮食减产、树木生长迟缓。围绕着杨絮治理的种种办法，效果却不令人满意。如果我们能从杨树的基因组中筛选出杨树开花的关键性基因，用基因编辑技术给予敲除，培育出不产生杨絮的品种，就能够一劳永逸地解决这个困扰性的问题。因此可以说，基因编辑技术在农业和林业上具有广泛的应用前景。

[1]Bibikova M,et al.Targeted chromosomal[J].Genetics,2002, 161(3):1169-75.

[2]Hockemeyer,Det al.Genetic engineering[J].Nature Biotechnology,2011,29(8):731-4.

[3]Jinek M,et al.A Programmable[J].Science,2012,337(6096): 816-21.

[4]Cong L,et al.Multiplex genome engineering using CRⅠSPR∕Cas systems[J].Science,2013,339(6121):819-23.

[5]Gao F,et al.DNA-guided[J].Nature biotechnology,2016.

[6]唐晓岚等.南京2种常见行道树致敏性及其控制措施[J].吉首大学学报:自然科学版,2014,35(3):69-73.

[7]刘健.怎样使二球悬铃木果絮不污染环境[J].中国花卉盆景, 2007(12):33-33.

[8]王爱霞,方炎明.二球悬铃木不同器官对空气中Cu、Ni、Pb和Zn的累积作用[J].植物资源与环境学报,2015(2):67-72.

[9]李萍.皖北杨絮的危害及防控[J].农业灾害研究,2014(11): 18-19.

[10]程心杰.杨絮的危害及解决措施[J].现代农业科技,2014 (16):155-156.