荧光分光光度法测定高良姜饮片中高良姜素的含量

杨　岚，支　岭，宋成军，苗光新，吴晓光，刘翠哲

(承德医学院，河北 承德　067000)



荧光分光光度法测定高良姜饮片中高良姜素的含量

杨岚，支岭，宋成军，苗光新，吴晓光，刘翠哲*

(承德医学院，河北 承德067000)

[摘要]目的：建立高良姜素含量测定的荧光分光光度法。方法：选择了荧光最佳的激发波长和发射波长，给出最佳分析参数。结果：在λex/λem=450 nm/528 nm条件下，荧光强度与高良姜素的含量在0.01～0.10 μg/mL呈良好的线性关系，测得高良姜饮片中高良姜素的含量为0.82%。结论：荧光分光光度法方法简便、快速、检测限低,准确度高，可用于药材高良姜饮片中高良姜素的含量测试。

[关键词]荧光分光光度法；高良姜饮片；高良姜素

高良姜是姜科山姜属植物高良姜Alpinia officinarum Hance的干燥根茎。其味辛，性温。具有温胃祛寒、理气祛风、消食止痛的功效。主治腹脘疼痛、胃寒吐泻、嗳气吞酸、消积食滞、消化不良等症，是中医临床上常用的温里药。高良姜素(Galangin，3，5，7-三羟基黄酮)是高良姜最主要的药理活性成分，对高良姜的鉴别具有独特的专属性。临床药理学研究表明高良姜素具有抗氧化、抗细菌、抗病毒等多种生理活性，具有良好的临床应用价值和研究前景[1-3]。

荧光分光光度法具有灵敏度高、专属性强、方法简便快速、检测限低、取样量少，工作曲线线形范围宽，仪器设备简单等优点，广泛应用于药物、生物样品及环境样品的分析及测定[4,5]。目前，测定高良姜饮片中高良姜素的含量方法主要为高效液相色谱法，但是高效液相色谱法具有仪器昂贵，检测周期长等缺点[6,7]。本实验利用高良姜素的荧光特性, 首次采用直接测定法，建立了高良姜饮片提取物中高良姜素的含量测定方法。

1材料

1.1试剂

高良姜饮片(同仁堂大药房)；高良姜素(中国药品生物制品检定所，批号：130501，纯度：99%)；乙醇、硼酸、磷酸、冰醋酸等试剂均为分析纯；双蒸水为实验室自制。

1.2仪器

F-4500荧光分光光度计(日本日立公司)；KQ-250DE型超声波清洗器(40 kHz) (昆山市超声仪器有限公司)；BS-210S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；pHS-3C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。

2方法

2.1高良姜素对照品溶液的配制

精密称取高良姜素1 mg置于烧杯中加无水乙醇溶解，将其转移至10 mL的容量瓶中，加无水乙醇定容至刻度。取1.0 mL该对照品溶液置于100 mL容量瓶中定容至刻度，得浓度为1.0 μg/mL的对照品溶液。

2.2三酸缓冲溶液的配制

精密称取硼酸2.47 g置于烧杯中加双蒸水溶解，再用移液管分别移取磷酸和冰醋酸各2.30 mL，将其全部转移至1 000 mL容量瓶中，用双蒸水定容至刻度，配制成三酸混合液。称取氢氧化钠2.0 g置于烧杯中加双蒸水溶解，将其转移至250 mL容量瓶中，用双蒸水定容至刻度。分别量取三酸混合溶液100 mL和不同体积的氢氧化钠与广口试剂瓶中混匀，用精密酸度计微调至所需的pH，分别得到6种不同pH值的三酸缓冲液。

2.3高良姜饮片提取物样品溶液的制备

取10 g粉碎的高良姜粉末置于锥形瓶中，加入浓度75%的乙醇溶液200 mL，在温度55 ℃，提取功率100 W，超声提取30 min，共提取3次，过滤，合并滤液，减压浓缩，无水乙醇溶解至10 mL备用。

3结果

3.1高良姜素的荧光激发光谱和发射光谱

精密量取高良姜素对照品溶液200 μL，加三酸缓冲液定容至2.0 mL，在300～700 nm波长范围内对高良姜素对照品溶液进行激发波长的扫描，高良姜素激发波长为450 nm，固定该激发波长，在450～700 nm范围内进行发射波长的扫描，得到其发射波长为528 nm。选择该最大激发波长和最大发射波长(即λex/λem=450 nm/528 nm)作为后继测定的工作条件。

3.2高良姜素对照品标准曲线的绘制

精密量取高良姜素对照品溶液0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μL，加三酸缓冲液分别定容至2.0 mL，在λex/λem=450 nm/528 nm处测定荧光强度，结果表明溶液的荧光强度(F)与溶液浓度(c)在0.01～0.10 μg/mL呈良好的线性关系。如图3-1、3-2所示。回归方程为：F=2 744.40 c+53.72，r=0.996 5。

图3-1高良姜素的荧光波谱(1～5浓度由低到高)

Fig 3-1The Fluorescence Spectroscopy of Galangin

(Concentration from Low to High 1～5)

图3-2　高良姜素溶液标准曲线

3.3缓冲溶液pH对高良姜素荧光强度的影响

本实验考察了不同pH的三酸缓冲溶液对高良姜素荧光强度的影响,如图2-3所示。

图3-3　缓冲溶液pH对体系荧光强度的影响结果

1.pH=9.02. pH=8.03. pH=10.04. pH=7.05. pH=11.06. pH=6.07. pH=4.0

从图3-3可以看出当pH在8.0～10.0时，高良姜素荧光强度最大且比较稳定，因此，本实验选定的缓冲溶液的pH为9.0。

3.4荧光分光光度法测定高良姜素含量的准确性实验

分别精密吸取高良姜素对照品溶液和样品溶液100.0 μL，加三酸缓冲液定容至2.0 mL，在λex/λem=450 nm/528 nm下测荧光强度。如图3-4所示，对照品溶液和样品溶液在相同位置出现最大吸收，该方法准确性良好。

图3-4　高良姜素含量的准确性实验

3.5荧光分光光度法测定高良姜素含量的稳定性实验

本实验考察了0、10、20、30、60、90、120、180 min8个反应时间对高良姜素荧光强度的影响，结果见表1。可以看出，随放置时间的延长，高良姜素的荧光强逐渐减小，计算RSD为2.2%，荧光强度在0～3 h内基本稳定，因此应保证在3 h内测定荧光。

表1　高良姜素含量的稳定性实验

3.6荧光分光光度法测定高良姜素含量的精密度实验

精密量取高良姜素样品溶液100.0 μL，加三酸缓冲溶液定容到2.0 mL，在λex/λem=450 nm/528 nm下测荧光强度。结果见表2，计算RSD为3.03%，由此可知，该方法的精密度良好。

3.7荧光分光光度法测定高良姜素含量的加样回收率实验

称取6份高良姜提取物样品溶液，进行加样回收实验，在λex/λem=450 nm/528 nm下测荧光强度。计算高良姜素平均回收率为98.99%，RSD为3.78%，表明该方法用于测定高良姜饮片中高良姜素的含量效果良好。

3.8荧光分光光度法测定高良姜提取物样品含量

称取高良姜粉末10.0 g，平行测定6组。按2.3项下样品溶液的制备方法制备样品溶液，在λex/λem=450 nm/528 nm下测荧光强度。计算高良姜素的平均含量为0.82%，RSD为5.50%。

4讨论

实验在确定高良姜素的激发光谱和发射光谱的基础上，进而研究体系中缓冲溶液、反应时间等因素对高良姜素荧光强度的影响，从而确定了最优条件，建立了高良姜饮片中高良姜素的荧光含量测定方法。

在缓冲溶液为pH为9.0时，高良姜素的荧光强度最大，从而选定缓冲溶液pH为9.0。通过稳定性实验、精密度实验、准确性实验检验了实验方法的可行性。测得高良姜饮片中高良姜素的含量为0.82%。

实验建立了荧光分光光度法测定高良姜饮片中高良姜素的含量，该方法取样量小、操作简便、快速灵敏。

[参考文献]

[1]张道广,王柯,季申.高良姜中高良姜素含量的高效液相色谱法测定[J].时珍国医国药,2010,21(12):3177-3178.

[2]邓亦峰,冯丽娜,罗辉.反相高效液相色潽法测定不同月份高良姜中高良姜素的含量[J].中国药学杂志,2010,45(20):1593-1595.

[3]康爱荣,闫明,彭英,等.高良姜中高良姜素的醇提和纯化工艺研究[J].中国中医药信息杂志,2011,18(5)：44-46.

[4]王晓蕾,白林,王琨,等.荧光分光光度法测定苯甘孢霉素的含量[J].解放军药学学报,2005,21(2):146-148.

[5]郑优娜,孙述文,唐林芳，等.荧光分光光度法测定大花红景天中红景天苷的含量[J].吉林医药学院学报,2013,34(5):323-326.

[6]马丽萍,丘小惠,闵江.高良姜饮片HPLC指纹图谱及高良姜素含量测定研究[J].中成药,2008,30(11):1565-1569.

[7]翟红莉,李倩,王辉,等.不同产地高良姜的有效成分分析[J].热带生物学报,2014,5(2):188-193.

本文编辑：王知平

·临床医学·

Determination of Galangin in Alpinia Officinarum Hance Pieces by Fluorescence Spectrophotometry

YANG Lan, ZHI Ling, SONG Chengjun, MIAO Guangxin, WU Xiaoguang, LIU Cuizhe

(ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,Hebei,China)

[ABSTRACT]Objective: To establish the fluorescence spectrophotometry method for the determination of galangin in alpinia officinarum hance pieces by fluorescence spectrophotometry. Methods: The optimum fluorescence excitation wavelength and emission wavelength was investigated. The optimum analytical parameters were obtained. Results:The linear range of galangin was 0.01～0.10 μg/mL under given condition of λex/λem=450 nm/528 nm. It was found that extraction using molecular imprinted polymers for selective extraction of flavonoid from alpinia officinarum was satisfactory. The content was 0.82%. Conclusions: The fluorescence spectrophotometry method is simple, rapid and highly accurative with a low detection limit, which shows good promising applications.

[KEYWORDS]fluorescence spectrophotometry; alpinia officinarum hance pieces; galangin

[中图分类号]R917

[文献标识码]A

[文章编号]1671-0126(2015)01-0001-03

[通讯作者]刘翠哲，女，教授，从事中药制剂现代化研究， E-mail：liucuizhexy@163.com

[作者简介]杨岚，女，助教，从事中药研究与开发工作

[基金项目]承德医学院科学技术研究基金(201413)