切梢小蠹伴生菌分离培养及其种类研究*



切梢小蠹伴生菌分离培养及其种类研究*

王晓渭1，袁瑞玲2,3，余俊旭4，李巧1，陈鹏2

(1.西南林业大学，云南昆明650224；2.云南省林业科学院，云南昆明650201；

3.云南省森林植物培育开发与利用重点实验室，云南昆明650201；4.云南大学，云南昆明650091)

摘要：为了探究切梢小蠹伴生菌的种类，在10个不同的地点采集树干内的切梢小蠹成虫及其坑道蓝变组织样品，采用MEA培养基对伴生菌进行分离、纯化和形态学鉴定。结果表明，切梢小蠹的伴生菌子实体和菌落形态各异，分属Ophiostoma和Leptogramphium。虫种上，云南切梢小蠹、横坑切梢小蠹和松芽小蠹的伴生菌多为Ophiostoma spp.，而华山松切梢小蠹伴生菌多为Leptogramphium spp.；寄主上，云南松和思茅松上的切梢小蠹伴生菌多为Ophiostoma spp.；而华山松上的小蠹虫伴生菌为Leptogramphium spp.。研究结果为揭示切梢小蠹的危害机理提供了基础信息。

关键词：切梢小蠹；伴生菌；寄主植物；多样性

切梢小蠹(Tomicusspp.)，隶属于鞘翅目(Coleoptera)多食亚目(Phytophaga)象虫总科(Curculionoidae)小蠹科(Scolytindae)切梢小蠹属(Tomicus)，是一种重要的蛀干性森林害虫，主要危害云南松(Pinusyunnanensis)、华山松(P.armandii)、马尾松(P.massoniana)、思茅松(P.kesiyavar.langbianensis)、高山松(P.densata)等多种松类植物[1]。目前切梢小蠹属有8个种[1]：纵坑切梢小蠹(Tomicuspiniperda)、横坑切梢小蠹(T.minor)、云南切梢小蠹(T.yunnanensis)、松芽小蠹(T.brevipilosus)、华山松切梢小蠹(T.armandii)、地中海切梢小蠹(T.destruens)、多毛切梢小蠹(T.pilifer)和颗瘤切梢小蠹(T.puellus)，其中横坑切梢小蠹、云南切梢小蠹、松芽小蠹、华山松切梢小蠹等4种在中国西南地区均有分布。

切梢小蠹对松类植物的危害分为蛀梢和蛀干2个时期：蛀梢期，其成虫取食枝梢髓心组织，进行补充营养，完成其成虫的性发育；蛀干期，性发育成熟的成虫由树梢转移到树干蛀食、产卵，形成母坑道和子坑道，其幼虫在树皮下发育，化蛹及羽化。切梢小蠹这一系列繁殖过程破坏了松树的韧皮部，使植物的水分和有机物运输功能受阻，最终导致树木死亡[2～3]。20世纪80年代至今，切梢小蠹在云南松林区暴发成灾，仅在云南省常年危害面积就达10×104hm2以上[4]，给当地林业产业造成了严重损失，对云南山区生态环境造成了严重破坏。

蠹害过程不仅是小蠹虫直接对树木的蛀食危害，而且在蛀害过程中小蠹虫常携带病原真菌即“小蠹虫伴生菌”侵入到树木中进行协同危害，能迅速削弱林木的抗病虫能力，加速了树木的死亡，研究表明，小蠹虫伴生菌是松类植物致死的另一个重要原因[5-6]。切梢小蠹伴生菌也叫蓝污真菌(Blue stain fungi)，经由小蠹虫携带到寄主植物体内，并对寄主植物产生一定致病作用，因此，蠹害是小蠹虫及其伴生菌的蛀害与侵染相互协同作用的结果[7]。

南非农林生物科技研究中心(Forestry & Agriculture Biotechnology Institute，简称FABI)是目前国际上研究小蠹虫伴生菌的权威机构，FABI对伴生菌的分类、特性、危害等方面的研究处在世界的前沿，仅Michael J.Wingfield命名或参与命名的Leptogramphium、Ophiostoma和Ceratocystis的伴生菌就达36个种[8-9]。国内对蠹害的研究起步较晚，大多注重于小蠹虫的生物生态学特性，而对于伴生菌的种类，伴生菌与小蠹虫和寄主植物的关系的研究尚少[6]。本项研究选择云南省和贵州省受切梢小蠹危害的云南松、华山松和思茅松等林份作为采样点，运用真菌学、森林病理学和昆虫学的基本研究方法，对切梢小蠹伴生菌进行培养，用形态学方法分类，探讨切梢小蠹伴生菌种类、以及伴生菌与切梢小蠹和寄主植物之间关系，以期为切梢小蠹及伴生菌的防治提供参考。

1材料与方法

1.1采样点

于2013年11月-2014年12月，在云南省和贵州省调查和采样，具体采样地包括：云南昆明、大理、丽江、曲靖、普洱、贵州盘县等地。采集的松类主要是云南松、华山松和思茅松。每个采样点随机选取5棵受害松树，将受害木伐倒后每棵树的主干取3段，每段长60 cm，将新鲜的木段及时带回实验室，对木段进行解剖，收集坑道内的切梢小蠹成虫，装入离心管编号，备用。用消毒后的解剖刀，割取出切梢小蠹成虫的坑道韧皮组织，放于培养皿中并编号，用于伴生菌的分离。

表1　切梢小蠹伴生菌采样信息一览表

1.2菌种的分离方法

菌种的分离方法由FABI提供[8～9]。根据小蠹虫伴生菌侵入寄主一段时间后，伴生菌会在寄主植物韧皮部和坑道上长成一个黑色菌柄和白色孢子体的子实体。因此，菌种的分离时，只挑取切梢小蠹母坑道内的伴生菌孢子进行分离纯化与培养。

具体方法：分离菌种的时候，直接将带有坑道的松树木片放在解剖镜下观察，如果直接能观察到伴生菌子实体，可用解剖针挑取伴生菌孢子，然后将孢子接种到培养基中培养分离；如果不能直接在解剖镜下观察到伴生菌子实体，则将带坑道的木块或蓝变的木块放在垫有虑纸的培养皿中，加入少量的蒸馏水，保持培养皿湿润，置于25℃下培养1-2周，期间每天观察木块是否长出子实体，长出后立即进行接种分离和纯化培养。

1.3菌种的培养、纯化和保存

1.3.1培养基

MEA培养基(配方为，20 g麦芽提取粉，20 g琼脂粉，蒸馏水1 000 mL)，用于伴生菌普通分离纯化培养；MEA选择培养基(配方为，20 g麦芽提取粉，20 g琼脂粉，0.5 g放线菌酮，0.4 g链霉素，蒸馏水1 000 mL)，用于在分离伴生菌时抑制细菌和其他真菌等杂菌的生长，从而更好地将伴生菌分离出来。MEA培养基和MEA选择培养基都置于25℃的恒温箱中培养。

1.3.2菌种的纯化

分离菌种接种到培养基1-2天后，在超净工作台内，用MEA培养基和MEA选择培养基，经过4～5次转接纯化，直到完全纯化，伴生菌在培养基上长成颜色相同，分布均一的菌落。

1.3.3菌种的保存

将纯化后的菌种接到外径为15 mm、长150 mm的试管斜面培养基，再置于4℃冰箱中保存。

1.4伴生菌的形态鉴定

伴生菌形态学鉴定，根据魏景超真菌鉴定手册和FABI伴生菌形态鉴定方法进行[8～11]。鉴定主要依据：是否产孢、产孢类型、孢子大小、和孢子形态，孢子梗形态、孢子梗颜色、孢子梗分隔；菌丝形态、菌丝颜色、菌丝隔膜、营养情况等；观察菌落形状、大小、颜色、质地、表面的纹饰、高度和边缘等特征[12]。

1.5切梢小蠹的鉴定方法

切梢小蠹鉴定参照叶辉[13]、吕军[4]和李霞[14]等小蠹虫形态学方法。

2结果与分析

2.1切梢小蠹的种类

共采集到50个标本，鉴定出4种切梢小蠹：云南切梢小蠹、横坑切梢小蠹、华山松切梢小蠹、松芽小蠹。其中，在云南省石林县长湖镇云南松林采集到横坑切梢小蠹、云南切梢小蠹和松芽小蠹；云南省大理州祥云县、云南省昆明市团结村和云南省丽江市玉龙县采集到横坑切梢小蠹和云南切梢小蠹，寄主为云南松；云南省陆良县张果山、贵州省六盘水市盘县和云南省普洱市墨江县、云南省普洱市宁洱县采集到横坑切梢小蠹和松芽小蠹，寄主分别为云南松和思茅松；云南省陆良县龙海乡在华山松上采集对华山松切梢小蠹；贵州省六盘水市盘县华山松林仅采集到华山松切梢小蠹。各采样点切梢小蠹种类如表2所示。

表2　不同树种切梢小蠹种类及伴生菌种类

2.2伴生菌类群的特征

2.2.1伴生菌菌落形态特征

伴生菌在MEA培养基上生长不一，但根据其特点，可以大体分为3类：(1)伴生菌生长较快，生长初期呈膜状，浅白色，后逐渐呈白色、褐色和橄榄色，菌落、菌苔湿润，菌丝可在培养基内生长，也可以在培养基表面成为气生菌丝，但气生菌丝并不发达，菌落微微凸起，2周后，培养基表面可见白色颗粒状絮状物出现(如图1a～f)。(2)伴生菌生长迅速，扩展较快，生长初期膜状无色，后来呈黑色，气生菌丝有的较发达，菌落微凸起，后期呈毛毯状；有的气生菌丝很不发达，贴着培养基表面生长，后期呈膜状均一(如图1g～k)。(3)菌落生长缓慢，光滑，中心浅黄色，外围呈白色，有凹痕，生长后期，菌种中心凸起(如图1l)。具体菌落形态见图1。

图1　伴生菌在培养基上菌落形态

图2　切梢小蠹伴生菌子实体的形态

2.2.2伴生菌形态特征

切梢小蠹伴生菌分有性和无性2种繁殖方式，镜检可见有2类菌丝：一类呈褐色，较粗，直径为8～10 μm；另一类无色，较细，直径为4～6 μm。分生孢子梗橄榄色，光滑、直立，有青霉状帚状枝，向下部分颜色较深，向上部分颜色较浅，长为108～240 μm。顶部由黏液黏呈球状，宽40～140 μm(如图2a、图2b)，分生孢子小梗4～7段，小梗顶端长有细长的产孢细胞，无色，长形或瓶状，产孢细胞产生棒状或圆形的环痕孢子，光滑、无色，4.8～10.8 μm×1.92～3.6 μm(如图2c、图2d，孢子成熟脱落下来后由黏液黏呈球状。

2.2.3切梢小蠹伴生菌初步鉴定

通过魏景超和FABI真菌形态学鉴定方法[8-11]，结合伴生菌分生孢子梗、分生孢子、菌丝和菌落特征，切梢小蠹伴生菌初步鉴定为2个属：Ophiostoma(图2c)和Leptogramphium(图2d)。由于国内对这2个属的种类记载较少，所以从形态学鉴定到种有一定的难度。其具体种名，还需借助分子系统学的方法进一步确定。

2.3伴生菌与切梢小蠹及寄主植物的关系

切梢小蠹对伴生菌具有一定的携带率，其中云南切梢小蠹对伴生菌的带菌率为12.29 %[15]。研究表明，切梢小蠹对伴生菌的携带率因蠹害程度而异，在蠹害重的地区，切梢小蠹带菌率较高，而在蠹害较轻的地区，带菌率相对较低[15]。切梢小蠹伴生菌带菌率的大小直接影响了其对寄主植物的危害水平。因此，蠹害是切梢小蠹与其伴生菌的共同危害和寄主植物的抗性相互作用的结果，切梢小蠹、伴生菌和寄主植物之间逐渐形成特定的关系。

切梢小蠹伴生菌是切梢小蠹的内生真菌，二者形成一种互利共生的关系[16].但由于切梢小蠹与其伴生菌种类的不同，切梢小蠹对伴生菌的携带具有特异性。由表2可知，横坑切梢小蠹、云南切梢小蠹和松芽小蠹的伴生菌多为(Ophiostomaspp.)；而华山松切梢小蠹伴生菌多为(Leptogramphiumspp.)。这种特定的共生关系，导致切梢小蠹与其伴生菌共同危害寄主植物。

不同切梢小蠹对不同寄主有一定的偏好性，在长期的进化和自然选择的作用下，使切梢小蠹和寄主植物形成特定的关系，而由于切梢小蠹伴生菌和寄主植物种类的不同，导致切梢小蠹的伴生菌对寄主植物寄生也是特定的。云南松和思茅松被侵染的伴生菌多为(Ophiostomaspp.)；而华山松被侵染的伴生菌为(Leptogramphiumspp.)。

总之，切梢小蠹伴生菌是Ophiostoma和Leptogramphium属中的某些种，而且可能有多个种，甚至有新种或新纪录种。由于切梢小蠹、伴生菌和寄主植物的种类多样，使它们三者之间形成的关系也是复杂多样的。

3讨论

切梢小蠹伴生菌根据FABI和真菌鉴定手册初步鉴定有2个属，但是由于国内真菌鉴定常用分类系统对Ophiostoma和Leptogramphium2个属分类地位的意见尚不统一，存在多种分类方式，所以这2个属在分类地位上需进一步对应或补充，也还需要进一步用分子系统学的方法验证。但可以肯定的是，小蠹虫伴生菌在国内种类丰富，其中在云南省Ophiostomaspp.和Leptogramphiumspp.较为普遍。由于切梢小蠹种类在云南省分布广、种类多，和寄主植物的差异性，伴生菌种类繁多，子实体和菌落形态各异，而且伴生菌与切梢小蠹和寄主植物的关系复杂。

切梢小蠹与其所携带的真菌之间所形成的关系为互利共生的关系。切梢小蠹的伴生菌通过对寄主植物的侵染而削弱植物抗性，有助于切梢小蠹的入侵，寄主树木的死亡是切梢小蠹与其伴生菌对于寄主植物动态相互作用的结果[16]。但是，寄主植物抵抗切梢小蠹与其伴生菌进攻的机制是随切梢小蠹及其伴生菌的种类不同而有差异，还是没有种的特异性尚待作进一步研究。同时，在切梢小蠹伴生菌和寄主树木的关系上，不仅表现为不同伴生菌种类寄生于不同的寄主植物，而且更重要的是伴生菌的不同的致病力导致寄主植物的死亡率不同[17]。但是，在致病力的差异上和使寄主致死机理上还不够明确，还有待进一步研究。

对于切梢小蠹伴生菌多样性的研究可以丰富真菌类群，进一步提高人们对切梢小蠹致病和寄主防御机制的理解。为此，应该加强对切梢小蠹伴生菌分类学研究；应该加强伴生菌与切梢小蠹的相互关系的研究[16]；应该加强伴生菌与寄主植物关系的研究，为今后更有效地进行切梢小蠹防治提供理论基础。

致谢：特别感谢南非农林生物科技研究中心的切梢小蠹伴生菌专家周旭东教授(博士后)和常润磊博士亲临指导伴生菌的分离，提供关于伴生菌分离和鉴定的方法。

参考文献：

[1]王晓渭,袁瑞玲,焦晓旭.等.云南切梢小蠹及其伴生真菌的研究进展[J].西部林业科学,2014,43(5):154-159.

[2]Chen Peng.Is there competition betweenTomicuspinierda(L.) andT.minor(Hart.) (Col.,Scolytidae) during shoot-feeding and breeding in China[D].Uppsala:Swedish University of Agricultural Sciences(SLU),2003.

[3]Lieutier F,Ye H.Shoot damage byTomicussp.(Coleoptera:Scolytidae) and effect onPinusyunnanensisresistance to subsequent reproductive attacks on the stem[J].Agric.For.Entomol,2003,5:227-233.

[4]吕军.中国西南地区4种切梢小蠹的发生、分布及危害机理研究[D].昆明：云南大学,2011.

[5]廖周瑜,叶辉.纵坑切梢小蠹伴生菌危害机理的研究[J].中国森林病虫,2002,21(3):3-5.

[6]廖周瑜.纵坑切梢小蠹伴生菌——云南半帚孢(Leptographiumyunnanense)危害机理与云南松抗性研究[D].昆明：云南大学,2002.

[7]叶辉,吕军.纵坑切梢小蠹蓝污真菌侵害云南松树组织解剖观察[J].林业科学,2001,37(6):71-74.

[8]Michael J.Wingfield,Keith A.Seifert,Joan F.Webber.CeratocystisandOphiostoma[M].Minnesota:American Phytopathological Society (APS)PRESS,1993:1-293.

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Species Diversity and Their Isolation and Cultivation of

Fungi Associated with Tomicus

WANG Xiao-wei1,YUAN Rui-ling2,3,YU Jun-xu4,LI Qiao1,CHEN Peng2

(1.Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224,P.R.China;2.Yunnan Academy of Forestry,Kunming Yunnan 650201,P.R.China；

3.Yunnan Key Laboratory of Forest Plant Cultivation & Utilization,Kunming Yunnan 650201,P.R.China；4.Yunnan University,Kunming Yunnan 650091)

Abstract:In order to study species variety of fungi associated with Tomicus,Tomicus adults in infected tunnels and blue stain tissues were collected from 10 sites,and MEA medium was used for isolating and purifying the fungi.The results showed that the form of the fungi’s fruiting bodies and colonies were different,and they were identified as two genuses,Leptogramphium and Ophiostoma.In terms of insect species,most fungi associated with Tomicus yunnanensis,T.minor and T.brevipilosus were Ophiostoma spp.,and most fungi associated with and T.armandii were Leptogramphium spp..In terms of host plant,most fungi in Pinus yunnanensis and P.kesiya var.langbianensis were Ophiostoma spp.,and most fungi in P.armandii were Leptogramphium spp..This study could provide basic information for revealing the damage mechanism of Tomicus.

Key words:Tomicus;associated fungi;host plants;species diversity

中图分类号：S 763

文献标识码：A

文章编号：1672-8246(2015)06-0042-06

通讯作者简介：陈鹏(1975-)，男，研究员，博士，主要从事森林保护与病虫害方面的研究。E-mail：13099919112@163.com

作者简介：第一王晓渭(1988-)，男，硕士研究生，主要从事森林保护方面的研究。E-mail：15198886280@163.com

基金项目：云南省应用基础重点项目“云南省切梢小蠹伴生真菌种类及在小蠹蛀害中的协同互作机制”(2013FA055)。

收稿日期：*2015-05-05