DNA分子鉴定技术在中成药真伪性鉴别中的应用与研究进展

陈蓉，吴成丽，邓赟，卞金辉



DNA分子鉴定技术在中成药真伪性鉴别中的应用与研究进展

陈蓉1，吴成丽1，邓赟2，卞金辉2

［摘要］中成药真伪性的准确鉴定是临床用药安全有效的前提所在，DNA分子鉴定技术是分子生物学上的一种常规技术，应用于中成药真伪性的鉴别是对目前中药质量控制体系的有效补充。本文主要从中成药DNA分子鉴定常规操作流程及DNA分子鉴定在中成药的真伪性鉴别中的应用研究方面进行了综述，并对其应用过程中存在的问题和发展前景进行了总结和展望。

［关键词］DNA分子鉴定；中成药；综述

［作者单位］1.成都中医药大学民族医药学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137

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DNA分子鉴定技术是指利用分子生物学技术对某物种或某个体中特异性的DNA序列进行分析鉴定，从而达到在分子水平上对物种和个体进行鉴定的目的，它作为近代科学技术发展的重要成果已经被广泛的应用到各物种的分类鉴定中来［1-3］。上个世纪90年代以来，不断有学者把DNA分子鉴定技术应用到中药的鉴定中来［4-7］，2010版药典及其增补本相继收录了乌梢蛇、蕲蛇的聚合酶链式反应（PCR）鉴别法、川贝母的聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性鉴别方法（PCR-RFLP），2015版药典还建立了《中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则》。由此可见，DNA分子鉴定技术有望成为继化学仪器分析技术应用于中药质量评价之后又一应用于中药质量控制的常规技术。

但是目前纳入标准的中药DNA分子鉴定技术主要集中在对中药材的鉴定上，对于中成药的DNA分子鉴定还未见收录。由于中成药的组成复杂，其质量控制难度更大，中成药中的造假、掺假现象也更为严重，而DNA分子鉴定技术具有快速、微量、特异性强等特点，能够对中成药中原料药材进行快速、准确鉴定，所以建立中成药的DNA分子鉴定方法对解决目前中成药质量控制中的一些难题显得非常迫切和必要。

本文搜集了近年来中成药DNA分子鉴定中的代表性研究成果，主要从中成药DNA分子鉴定常规操作流程及DNA分子鉴定在中成药真伪性鉴别中的应用研究方面进行综述和总结，并对其目前应用中存在的问题及发展前景进行了展望。

1　DNA分子鉴定技术鉴别中成药真伪性的一般流程

1.1 中成药中基因组DNA的提取

目前常用的基因组DNA提取方法包括CTAB法、SDS法、离心柱型试剂盒法、磁珠试剂盒法等。罗［8］等人以麦冬为例，对上述常用DNA提取方法在中药中的应用进行了比较研究，研究发现改良CTAB法提取出的DNA质量和数量为最优，陈玉秀［9］、杜向红［10］、刘丽华［11］、刘杨［12］等也针对不同的药材，分别对CTAB法进行改进，提高了中药玉竹、蒲公英、景天三七、吴茱萸等药材中DNA的提取效率；但是陈莉等［13］在利用CTAB法和SDS法对丹参、绞股蓝、三七进行DNA提取的研究中发现，丹参、绞股蓝的DNA适用于CTAB法提取，而三七的DNA更适合用SDS法提取，其原因是不同植物中含有不同的次生代谢产物，这些次生代谢产物会不同程度的影响DNA的提取。Chen R［14］等也发现对于不同剂型的中成药也需要根据样品特征选取不同的DNA提取方法，比如固体制剂可选用改良的CTAB法，而液体制剂则需要采用乙醇重结晶或者是柱吸附试剂盒进行富集提取。由此可见，对于中成药的DNA提取，目前还没有通用的方法，需要根据待检测中成药中不同的药材以及不同的制剂类型设计优化相关的DNA提取方法。

1.2 中成药中目的DNA的扩增

对于中成药中目的DNA的扩增，按照所用引物分类可分为通用引物PCR法以及特异性引物PCR法。通用引物对于植物一般采用ITS2或者psbA-trnH区域通用引物，对于动物一般采用COI序列通用引物进行扩增［15］。特异性引物PCR则需要根据不同的检测对象选择其特异性DNA序列，并设计特异性引物对其进行扩增［16， 17］，这两类方法各有优缺点，通用引物PCR法无需设计特异性引物，在PCR方案设计当中相对简单，但是对于扩增产物的检测则需要依靠DNA测序仪等；特异性引物PCR法前期建立方法时需要对待检测品种及其混伪品进行序列比对，并设计特异性引物，但是在后期PCR产物检测中则依靠常规的琼脂糖凝胶电泳等手段即可快速获得检测结果，利于此类检测方法的推广。

此外，目前已报道的中成药的DNA分子鉴定中目标序列的扩增，按照操作流程则可分为普通PCR和巢式PCR，巢式PCR是在普通PCR之前，利用通用引物或者特异性引物对待检测样品再进行一次PCR操作，可以达到富集DNA和提高特异性的目的，适用于对复杂样本组［18］或者极其微量DNA的扩增［14］。

1.3 中成药中目的DNA扩增产物的检测

在分子生物学技术中，对于PCR扩增产物的检测有较多方法：经典的琼脂糖凝胶电泳检测技术，新进发展起来的第一代、第二代高通量测序技术，可以定量的荧光定量PCR技术，以及纳米金、比色探针等可视化检测技术。对于中成药目的DNA扩增产物的检测，可以根据具体需要选用适当的PCR扩增产物检测方法，目前已报道的有：玉屏风散中白术、黄芪、防风等药材的鉴定采用琼脂糖凝胶电泳检测［19］；连翘败毒丸中金银花的鉴定采用第一代测序法检测［20］，八宝清心散等中成药中原药材的鉴定采用第二代高通量测序法［21］；生脉饮、乌鸡白凤丸等中成药中人参药材的检测采用G-四聚体比色探针法等［14］。

2　DNA分子鉴定技术在中成药真伪性鉴别中的应用

中成药不同于中药材在于，中药材为单一动物或者植物样本，而中成药除少数是单味药组成外其余均为多种药材混合加工而成，并有多种制剂方式，其基因组DNA较为复杂，对其进行检测也更加困难。此外，在制剂工艺中，中成药中的药材，有的经过研磨粉碎直接入药，有的经过煎煮提取以提取液形式入药，有的在提取过程中还加入了乙醇进行沉淀等，这些加工都在不同程度上都降低了药材DNA的质量和数量。同时，多种药用辅料的加入，如蜂蜜、淀粉、糖包衣等对DNA的提取也造成了极大的困难，所以根据剂型不同以及中成药的具体制剂工艺不同，对其中药材DNA的鉴定方案也有所不同。

2.1 以原药材直接入药的中成药

2.1.1 单味药材组成的中成药或保健品 目前市售的部分中成药或者保健品是由单味药材组成，这种药品大多是一些贵重中药，具有较高的经济价值，其掺假现象也比较严重，建立这类药品的DNA分子鉴定方法能准确的判断该药品的真伪性，因此有较大的应用价值。同时，仅含有单味药材的中成药其成分也相对单一，DNA提取和鉴定均可采用中药材DNA鉴定所用的方法，难度较低。

Mihalov JJ［22］等人利用DNA测序技术对植物的ITS序列进行测序，成功地鉴别了西方市场上混淆流通的人参和西洋参的粉末制品、片剂和胶囊剂等。王巍［23］等人利用特异性引物PCR技术对全天麻胶囊中的天麻及常见伪品进行了鉴定，不仅建立了天麻的特异性引物PCR鉴定法，还成功的从某厂家的全天麻胶囊中检测出天麻常见伪品马铃薯的DNA。刘光全［24］等人利用ITS序列分析技术对3个不同厂家的虫草胶囊进行了分析，结果发现有2个厂家所用样品为西藏虫草和蛹虫草，均与其产品名称“冬虫夏草”

不相符合，也不属于国家卫计委允许的保健食品菌株。目前冬虫夏草的药典标准仅规定腺苷的含量不低于0.010%，腺苷是一种非特异性化合物，广泛存在于各种动植物药中，上述西藏虫草和蛹虫草中也存在较高含量的腺苷，所以腺苷的测定不能有效的控制冬虫夏草及其成药或者保健品的质量，而通过DNA分子鉴定则能直接有效地鉴别出其真伪性。

2.1.2 多味药材组成的中成药 对于一些由多味中药材配伍而成的中成药的DNA分子鉴定，目前也有相关报道。Coghlan， M. L［21］等人利用第二代高通量测序技术对澳大利亚海关扣留的包括粉剂、片剂、胶囊剂等在内的15种中药样品进行测序分析，鉴定出了68种动植物品种，发现了濒危物种亚洲黑熊和高鼻羚的DNA，这不仅为中药质量控制提供了新技术，也为药品监管、非法贸易的查处提供了技术支持。但是就目前而言，第二代高通量测序技术相对来说普及面较窄，价格较高，序列分析技术壁垒较高，更多应用于医学检测，在中成药真伪性鉴别中的应用前景还比较有限。崔占虎［18］等利用特异性引物PCR技术结合DNA测序对包括连翘败毒丸、牛黄清宫丸、健脑补肾丸、金噪开音丸等在内的6种含有金银花药材的中成药进行了分析，在6种样品中均成功检测出了金银花的特异性DNA序列。但是该法采用了巢式PCR操作，首先利用通用引物对trnL-trnF叶绿体序列进行扩增富集，再将PCR产物稀释后，用金银花特异性引物进行第二轮PCR，最后将扩增产物经克隆测序得分析结果。巢式PCR的引入使操作更加繁琐，也提高了PCR污染的几率。同时通过克隆测序对检测结果进行分析虽然使检测结果更加直观可靠，但是也进一步延长了检测周期，提高了检测成本，所以该方法在技术上还需要进一步改进。此外， Cheng KT［25］等首次利用随机扩增多态性（RAPD）技术对著名中成药“玉屏风散”中的白术、黄芪、防风等药材进行了鉴别研究；随后，李会军［26］等人同样利用该技术，建立了中成药中川贝母的DNA标准图谱，利用待测样品的DNA图谱与标准图谱相比较，从而判断待检测中成药的真伪性；崔占虎［20］等利用psbA-trnH和rbcL两个叶绿体通用引物对中成药连翘败毒丸中植物药材的DNA进行扩增，再将扩增产物进行分子克隆，通过挑取单克隆测序的方法鉴定出了连翘败毒丸中6种原料药材；Chen R［14］等人采用特异性引物PCR技术对含有人参的中成药进行分析，在其片剂、丸剂等剂型中均成功扩增出人参的特异性DNA条带，这些都是DNA分子鉴定技术对多味药材组成的中成药鉴别的有益尝试。

2.2 以提取液入药的中成药

中成药的一些新剂型中有些中药材是以提取液入药的，如复方丹参滴丸中的三七、地奥心血康胶囊中的薯蓣以及各种口服液、注射液中的各类药材等，而现代提取工艺中主要用水提法、醇提法等，由于DNA不溶于乙醇，所以对经过乙醇提取以及经过乙醇沉淀的提取液，其中大部分DNA会被除去，仅留下极少量的DNA，这大大提高了此类中成药中中药材DNA提取和鉴定的难度，即使对水提取液入药的中成药，其DNA富集和鉴定的难度也较大，目前这方面的相关报道也较少。Chen R［14］等人曾利用巢式PCR技术检测出了藿香正气水中的半夏以及常见伪品虎掌半夏、水半夏，直接有效的解决了藿香正气水中半夏掺假鉴定的难题。由此可见，对于部分以提取液入药的中成药中微量的DNA也可以通过扩增后检测。该文章还建立了含有人参和党参口服液以及注射液中对应药材的检测方法，并以比色探针为基础开发了可视化检测芯片技术代替传统的琼脂糖凝胶电泳检测，提高了检测效率，并使检测结果更加直观、可靠。

3　展望

综上，随着2015版药典《中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则》的建立，将会有越来越多的中药材DNA分子鉴定方法被收入药典，同时也会有越来越多的研究聚焦到中成药的DNA分子鉴定上来，利用其解决中成药质量控制中真伪鉴别等的一些难题，有效弥补现有分析方法的不足。但中成药的DNA分子鉴定技术还存在一些亟待解决的问题，首先由于中成药本身组成复杂、品种繁多、制剂不同、辅料添加等原因存在，增加了中成药DNA分子鉴定的难度；其次，中成药DNA分子鉴定是从分子角度对中成药中所用药材的“真伪”进行鉴别，对于药品的质量尚无法进行判断；第三，对于利用正品药材非药用部位的掺假等也并不能鉴别。所以，我们要正确认识和利用DNA分子鉴定技术的优势，建立和完善相应中成药的质量控制、评价标准，从而不断推进中药现代化的进程。

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（责任编辑：胡慧玲）

DNA identification of Chinese patent medicines: A review

CHEN Rong1， WU Cheng-li2， DENG Yun2， BIAN Jin-hui2// （1.

School of Ethnomedicine， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， Sichuan； 2. School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， Sichuan）

［Key words］DNA identification； Chinese patent medicines； review

［Abstract］To ensure clinical safety and efficacy， it is very important that the Chinese Patent Medicines （CPMs） are accurately identified. DNA identification which is conventionally used in molecular biology can be an effective supplementary of CPMs’quality control. This article reviews the general protocol of CPMs’ DNA identification and its application in the quality evaluation of Traditional Chinese Medicines. Additionally， the current problems and future development of CPMs’ DNA identification are also prospected at the end.

［中图分类号］R 284.1

［文献标识码］A

［文章编号］1674-926X（2016）02-026-04

［基金项目］四 川省教育厅理工科一般项目（14ZB0077）；成都中医药大学科技发展基金（ZRQN1434）；四川省科技厅项目（2014SZ0071-4）

［作者简介］陈 蓉（1987-），女，硕士，助教，主要从事中药DNA分子鉴定研究

［通讯作者］卞 金辉（1975-），男，副教授，主要从事中药药效物质基础及质量标准研究

［收稿日期］2015-09-12