结核分枝杆菌耐药表型与耐药基因型相关性研究进展

陈 珊(CHEN Shan)，刘厚明(LIU Hou-ming)，单万水(SHAN Wan-shui)

(1 广东医科大学，广东 湛江 524000； 2 深圳市第三人民医院，广东 深圳 518000)



·综述·

结核分枝杆菌耐药表型与耐药基因型相关性研究进展

陈 珊(CHEN Shan)1，刘厚明(LIU Hou-ming)2，单万水(SHAN Wan-shui)2

(1 广东医科大学，广东 湛江 524000； 2 深圳市第三人民医院，广东 深圳 518000)

结核分枝杆菌； 分子机制； 表型耐药； 耐药基因

20世纪80年代以来，结核病(tuberculosis，TB)疫情呈全球性回升趋势，我国作为全球最大的发展中国家，同时也是全球TB疫情最严重的国家之一[1]。随着全球耐药结核病(drug-resistant tuberculosis，DR-TB)的出现和传播，特别是耐多药结核病(multidrug-resistant TB，MDR-TB)、广泛耐药结核病(extensively drug-resistant TB，XDR-TB),以及全耐药结核病(totally drug-resistant TB，TDR-TB)发生率的增高，全球TB的有效治疗和控制受到严重威胁。深入研究结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的耐药分子机制，发现基因突变是MTB产生耐药的重要原因。现就各抗结核药物的耐药表型与耐药基因型的相关性研究进行综述。

1 MTB耐利福平(rifampin，RFP)

RFP为半合成广谱杀菌剂，是最有效的抗结核药物之一，在短期化学治疗中起重要作用。RFP通过与细菌RNA聚合酶的β亚单位牢固结合，抑制细菌mRNA的合成，防止该酶与DNA连接，从而干扰、阻断RNA转录过程。MTB RNA聚合酶β亚单位由rpoB基因编码，当rpoB基因个别密码子发生突变时，DNA依赖性RNA聚合酶β亚单位的空间构象发生改变，无法与RFP结合，从而表现为耐药。

现已知95%～99%的MTB耐RFP主要是因rpoB基因在507-533位密码子共81 bp的核心区域内(rifampicin resistance determining region，RRDR)[2-3]碱基发生突变、缺失、颠换等导致。最常见的突变位点为531位点TCG(Ser)-TTG(Leu)，526位点CAC(His)-TAC(Tyr)、GAC(Asp)、CTC(Leu)，516位点GAC(Asp)-GTC(Val)[4]。已发现的突变位点还有450、511、512、513、514、515、517、518、522、524、530、533位点等。近年来，RFP耐药基因rpoB的突变特征成为各国研究热点，不同国家报道的rpoB基因突变位点及每个位点的突变率并不完全相同。孟加拉的研究[5]表明，207株耐RFP菌株中，最常见的突变位点为531(57.4%)，其次526(22.9%)、516(7.3%)，个别菌株在513、530、533位点突变，另有5%耐药菌株未发现基因突变。在531位点有相似突变率的国家不在少数，如尼泊尔为57.8%[6]，摩洛哥为59.6%[7]，新加坡为54.9%[8]，泰国为58.5%[9]，巴西为56.1%[10]等；较高突变率的国家有西班牙(72.3%)[11]、缅甸(63.6%)[12]。由此可见，rpoB基因有明显的地域性突变差异。针对耐RFP临床分离株的研究中发现(MIC法测定结果)，RRDR区域内不同碱基突变耐RFP水平不同，531、526和516位点突变常导致高水平耐药(MIC>32 μg/mL)，511、513、514、533位点突变一般引起低水平耐药。此外，研究[13]表明，约90%的耐RFP菌株往往也耐其他一线抗结核药物。耐RFP是判断MDR-TB菌株的风向标，而rpoB基因突变为RFP耐药的主要原因，由此可见，快速、准确检测rpoB基因突变不仅有助于指导临床精准用药，提高疗效，而且可有效防控MDR-TB的传播。

2 MTB耐异烟肼(isoniazid，INH)

INH是一种前体药，性质稳定，通过被动扩散方式进入增长期的MTB中，由菌体内过氧化氢-过氧化物酶(katG酶)激活，产生活化的游离自由基，如活性氧化物、活性有机物等，能抑制细胞壁分枝菌酸的合成，破坏细胞壁的完整性，引起细菌增殖力、抗酸性等生理功能丧失，达到杀菌目的。研究[14]发现，使用INH一段时间后，INH本身会诱导MTB基因突变，产生基因型耐INH菌株。INH耐药机制复杂，涉及菌体中的KatG酶、烯酰脂酰载体蛋白还原酶(inhA)、β-酮酰基运载蛋白合成酶(kasA)、烷基过氧化氢酶还原酶(ahpC)和还原型辅酶Ⅰ脱氢酶(ndh)等多基因突变。

2.1KatG基因KatG基因编码KatG酶，在菌体内将INH氧化成异烟酸，参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶I(NAD)的合成，抑制细胞壁分枝菌酸的合成。当KatG基因发生完全缺失或突变时，导致细胞中过氧化氢酶不被表达或活性降低，从而引起结核分枝杆菌对INH耐药。绝大部分耐INH菌株中均有KatG基因表达，仅24%的耐INH结核菌株中KatG基因完全缺失，且均是MIC>50 μg/mL的高度耐药株。KatG基因突变可能是MTB耐INH更重要、更普遍的原因。30%～95%的耐INH菌株存在KatG突变。有记载的KatG突变位点约300种，最常见的是密码子S315(AGC)突变成苏氨酸(ACC)、天冬氨酸(AAC)、精氨酸(CGC)、异亮氨酸(ATC)、甘氨酸(GGC)等，94%以上是S315T突变。另有104、108、 138、 141、148、 270、 275、314、328、341、378、381、394、420、 463、494、553、595、658等位点突变，大部分可导致INH耐药。据报道[15]，不同碱基突变的菌株其过氧化氢酶活性及INH耐受程度不同。如S315T、W341G、G494D和R595S等与高浓度INH耐药有关，而S315N、L141F、 E553K和 F658V等与低浓度INH耐药有关。但是，并非所有密码子突变均与INH耐药有关，如R463L位点突变较常见，且在INH敏感株中的突变率高于耐药株，但其突变并不影响KatG酶活性，提示该突变位点的存在为基因多态性[16]。简言之，KatG基因S315T是结核菌株耐INH的主要分子机制，但也有因基因多态性而存在的突变位点和无KatG基因突变却耐INH的菌株，提示MTB中存在其他耐INH的途径。

2.2inhA基因inhA基因编码烯酰基乙酰载体蛋白还原酶，分子量约为32 kd的蛋白质，参与分枝菌酸的生物合成，是INH的作用靶点。inhA突变多见于调节序列的启动子区，包括点突变和碱基缺失，突变频率较高的位点包括C-15T、T-8C，目前发现的突变位点还有16、72、90、94、98、105等。Tekwu等[17]研究发现，低水平耐INH菌株中，inhA(C-15T)突变率达50%(10/20)，因此认为inhA编码基因的突变常见于低耐药菌(MIC=0.2 μg/mL)。各地区耐INH菌株中inhA基因突变率并不相同，陈杨等[18]研究结果为30%，韦红玉等[19]研究结果为20%。inhA除单一位点突变外，少部分联合KatG出现双基因突变，占耐药菌株的8.5%，当inhA与KatG基因联合突变时，INH的耐药性明显增强。

2.3oxyR-ahpC基因区oxyR基因编码的蛋白既是基因转录的活化剂，又是感受氧压的感受器。oxyR基因本身无生物活性，是一假性基因，与MTB对INH的敏感性无关，但因oxyR蛋白参与KatG和ahpC基因的表达，因而与MTB的耐药性有关。ahpC基因启动子位于oxyR-ahpC基因区，耐INH菌株常在此区域发生突变。据研究[20]报道，在MTB耐INH临床分离株中，oxyR-ahpC突变率可达39.6%(19/48)，其中G-46A突变位点占31.2%。当oxyR-ahpC突变，能代偿性增加ahpC表达，填补KatG酶的缺乏，为MTB抗氧化应激反应提供保护。有学者视ahpC突变为KatG损伤的一种标志，然而两者并无直接因果关系，大部分耐INH菌株发生KatG突变时并不伴有ahpC突变。

2.4kasA基因kasA基因编码β-酮酰基运载蛋白合成酶，属Ⅱ型脂肪酸合酶系统，参与分枝菌酸的合成。kasA基因突变不常见，占异烟肼INH耐药菌株的10%，已发现的突变位点有66、121、269、312 和387等，其中G312S最常见，但在部分INH敏感株中亦存在312位点突变，因此考虑该突变位点可能为基因多态性。除312位点外，KasA基因中还存在部分INH耐菌株和敏感株中均有的突变位点，所以KasA基因在MTB产生INH耐药过程中的作用仍需进一步研究。

2.5 其他基因 除KatG、inhA、oxyR-ahpC、KasA等基因外，近年还发现许多可能与MTB耐INH有关的基因，如ndh、iniA、iniB、iniC、accD6、efpA、furA、nal、msbA等。如ndh基因编码NADH脱氢酶，突变可引起酶活性缺失，NADH含量增加，NAD+减少，NADH/NAD+比例改变，使INH过氧化被抑制造成耐药，常见突变位点V18A。上述大多基因与INH耐药的关系并未十分明确，还有待进一步研究证实。

3 MTB耐链霉素(streptomycin，SM)

SM是氨基环醇糖苷类抗生素，通过诱导遗传密码错读，抑制翻译启动及干扰校正过程，影响蛋白质的合成而发挥抗菌作用。研究[21]表明，编码小亚基核糖体蛋白S12的rpsL和编码16SrRNA的rrs基因突变是MTB耐SM的主要分子机制。约80%耐SM菌株存在rpsL或rrs突变，其中rpsL突变率高于rrs。rpsL最常见突变位点是第43和88位密码子，第43位密码子不仅突变率最高，且与高浓度SM耐药有关。该位点有限制性内切酶MboⅡ的识别序列(GAAGGA)，易使Lys突变为Arg，部分菌株Lys-Thr。在耐SM菌株中，rrs突变主要集中于530茎-环区和915核苷区，已发现426(G-C)、491(C-T)、512(C-T)、513(A-C)、513(A-T)、514(A-C)、516(C-T)、903(C-G)、903(C-A)、904(A-C)、905(A-G)等突变位点。部分菌株有双突变位点，如rrs513(A-C)合并rpsL43(A-G)，rrs905(A-G)合并rpsL88(A-G)，但类似联合突变不常见。近年有学者认为，7-甲基鸟苷-甲基转移酶的编码基因gidB与低水平SM耐药有关，gidB基因突变使保守的M7G甲基化转移酶修饰丢失，从而产生低水平SM耐药[22-23]。但在RFP、INH耐药而SM敏感的菌株中亦有gidB突变，因此需加强gidB与SM表型耐药相关性的研究。除上述耐药基因外，约1/3的临床SM耐药株无rpsL或rrs突变，提示可能有其他SM耐药机制存在。

4 MTB耐乙胺丁醇(ethambutol，EMB)

EMB是一种合成的阿拉伯糖类药物，发挥抗菌效力最关键的作用靶点是阿拉伯糖基转移酶。EMB能抑制其聚合阿拉伯半乳聚糖，从而影响分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖复合物(细胞壁的重要成分)的形成，同时使RFP等药物更易进入细胞内，因而EMB与RFP具有协同抗结核的作用。编码阿拉伯糖基转移酶的embABC操纵子突变或emb蛋白过度表达与EMB耐药密切相关，过度表达引起EMB低耐药，基因突变导致EMB高耐药。embABC操纵子由embC、embA、embB 3个基因组成，其中embB基因突变是MTB耐EMB的主要原因。embB基因约3 246 bp，编码1个糖基转移酶，其突变可导致糖基转移酶结构改变，影响EMB与糖基转移酶的相互作用产生耐药。embB基因最常见第306位突变，占embB基因突变的90%，包括M306V、M306I、M306L。此外，第285、306、313、319、328、330、406、497及630位等密码子突变可引起EMB耐药。但是，学术界对embB306突变与EMB耐药关系存在争议。普遍认为embB306突变可作为快速诊断MDR的标准[24]，但也有研究发现，embB306突变不仅存在于EMB耐药株中，部分敏感株中亦有。

5 MTB耐吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)

PZA为烟酰胺类似物，最大特点是需要在酸性环境中才表现出抗菌活性，杀死半休眠期MTB，且MIC与pH呈正相关性。PZA在细胞外酸性环境下渗透进入MTB内，菌体内的吡嗪酰胺酶(PZase)将其转化为对MTB有毒性作用的吡嗪酸(POA)而发挥杀菌作用。PZase高活性是PZA发挥抗MTB作用的关键，而PZase编码基因pncA突变造成的PZase活性缺失或降低被认为是MTB耐PZA的主要原因。pncA基因约561 bp，其突变类型包括点突变、上游调控序列变异、核苷酸插入或缺失、小片段插入等。目前，已发现的pncA突变位点约175种，呈弥散分布无规律可循，最常见突变位点为A-11G，还有第47位(Thr-Ala)，第85位(Leu-Pro)。研究[25]发现，部分PZA耐药株中并未出现pncA基因突变，且少数EMB耐药株发生了pncA突变但未对PZase活性产生明显影响，表明pncA突变并非唯一的PZA耐药机制。

6 结语

综上所述，MTB菌体内与抗结核药物作用靶点有关的编码基因突变是结核菌耐药的主要作用机制，但大部分药物仍存在其他耐药机制，有待进一步研究发现，耐药表型与基因型之间的相关性仍需进一步深入研究。因此，加强对抗结核药物作用机制及MDR耐药机制的研究，寻找与耐药基因突变有关的诱导因素，并建立新的高效、灵敏、特异、价廉的结核菌耐药性检测方法十分必要。总之，人类在抗TB的道路上任重而道远，但笔者坚信，随着分子生物学及遗传学的发展，新型检测技术的成熟，在不久的将来包括TB及MDR-TB在内的很多传染病都会从根本上得到遏制。

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(本文编辑：左双燕)

Advances in correlation between drug resistance phenotype and genotype ofMycobacteriumtuberculosis

(1 Guangdong Medical University, Zhanjiang 524000, China; 2 The Third People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518000, China)

2016-05-24

深圳市科技计划项目(JCYJ20140411113637598)；深圳市科技研发资金项目(JCYJ20130401164749996)；深圳市“三名工程”专项资金

陈珊(1990-)，女(汉族)，湖南省益阳市人，硕士研究生，主要从事结核分枝杆菌耐药性分子机制及检测方法的研究。

单万水 E-mail：13923478156@qq.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.11.021

R378.91+1

A

1671-9638(2016)11-0883-04