2种表型试验检测葡萄球菌诱导型克林霉素耐药的评估及基因分析



2种表型试验检测葡萄球菌诱导型克林霉素耐药的评估及基因分析

葡萄球菌属中所有的菌种都有较大的潜在致病性，已成为临床抗感染治疗的一大难题[1-2]。1968年有学者报道2例耐红霉素金黄色葡萄球菌引起的感染，治疗前对克林霉素和林可霉素均敏感，但治疗后林可霉素却变为耐药，于是作者推测克林霉素和林可霉素治疗此类菌可能会引起治疗无效[3]。大环内酯类(如红霉素)-林可酰胺类(如克林霉素)-链阳霉素B类复合药物(macrolide-lincosamide-streptogramin B，MLS)为治疗葡萄球菌感染的常用药物[4]，在多数菌属中，红霉素一直是较强的诱导剂，具有诱导克林霉素耐药的作用。因此，如何合理使用MLS已经成为人们关注的焦点[5]。为此，实验室有必要开展试验对克林霉素诱导耐药的菌株进行检测并报告临床。为评价MicroScan革兰阳性复合板(简称PC33复合板)检测葡萄球菌属诱导型克林霉素耐药的性能，本研究对医院分离到的红霉素耐药而克林霉素敏感的葡萄球菌以D试验(双纸片法检测克林霉素诱导耐药试验)为判断标准，用PC33复合板进行诱导型克林霉素耐药检测，同时通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)进一步了解其基因分布情况。

材料和方法

一、材料

1.菌株来源复苏同济大学附属第十人民医院2013年6月至2014年6月PC33复合板结果为红霉素耐药而克林霉素敏感的葡萄球菌(使用Walkaway 96 plus全自动微生物鉴定和药物敏感性分析仪)共115株，其中金黄色葡萄球菌31株、凝固酶阴性葡萄球菌84株。从同一患者同一部位多次分离的相同菌株按1次统计。菌株均来自同济大学附属第十人民医院住院和门诊患者送检的样本,包括痰液、咽拭子、尿液、脓液、分泌物、血液、透析液等。质控菌株：金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)作为PC33复合板的质控菌株，金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)作为纸片扩散法药物敏感性试验的质控菌株。

2.培养基及药物敏感性纸片水解酪蛋白胨琼脂培养基为上海伊华生物公司产品；红霉素(15 μg/片)、克林霉素(2 μg/片)为英国Oxoid公司产品。

3.试剂与仪器DNA抽提试剂盒及PCR试剂盒(TaKaRa公司)；2种耐药基因的PCR引物(上海宝生物公司)；9700型基因扩增仪(美国MJRearch公司)；电泳仪(上海天能公司)；凝胶成像系统(美国伯乐公司)。

二、方法

1.菌株鉴定115株菌株用革兰染色、凝固酶试验、西门子Walkaway 96 plus全自动微生物鉴定和药物敏感性分析仪及其配套的PC33复合板进行鉴定。

2.体外药物敏感性分析采用PC33复合板联合孔进行常规鉴定药物敏感性分析，35 ℃培养16～18 h，观察含红霉素和克林霉素联合孔(含4 μg/mL红霉素和0.5 μg/mL克林霉素)是否有菌生长来判断结果。

3.D试验按照美国临床实验室标准化协会(the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)标准进行操作和判读[6]。挑选在35 ℃有氧环境孵育18～24 h的单个菌落，将0.5麦氏单位的新鲜菌液均匀涂布于水解酪蛋白胨琼脂平板，在相距15 mm处(边缘到边缘)分别贴上红霉素(15 μg/片)和克林霉素(2 μg/片)纸片。35 ℃有氧环境孵育18～24 h后，按照红霉素14～22 mm、克林霉素15～20 mm的标准判读。

4.相关耐药基因检测(1)DNA抽提：所有试验菌株经DNA抽提试剂盒抽提后用PCR扩增试剂盒进行模板制备；(2)引物设计及PCR扩增：PCR引物参考文献[7]，反应过程见表1；(3)扩增产物分析：PCR产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，100 V电泳45 min后紫外光线下观察结果，置入凝胶成像仪中观察并记录结果。在预计位置420 和572 bp处出现条带，分别为ermA、ermC基因。

表1　引物序列和PCR循环条件

三、统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析。计数资料以百分率表示，2种方法的结果进行配对χ2检验，显著性检验水准α=0.05。同时以D试验法为判断标准评估PC33复合板检测克林霉素诱导耐药的敏感性及特异性。

结果

一、PC33复合板诱导孔结果及诱导耐药的检出率

含红霉素和克林霉素联合孔内有菌生长为诱导试验阳性，不生长为阴性。PC33复合板耐药检出率分别为金黄色葡萄球菌61.3%(19/31)、凝固酶阴性葡萄球菌47.6%(40/84)。见表2。

二、D试验测定诱导耐药表型结果及诱导耐药的检出率

当克林霉素在靠近红霉素纸片一侧出现截平现象，即克林霉素纸片的抑菌环看似大写的“D”时(称为“D”抑菌环)提示存在可诱导的克林霉素耐药，为诱导型MLS(inducible macrolide-lincosamide-streptogramin B，iMLS )耐药，即D试验阳性；如果红霉素和克林霉素均耐药，则为结构型MLS(constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B，cMLS)耐药；如果克林霉素抑菌环仍为圆形，为MS表型，即D试验阴性。见图1。D试验耐药的检出率分别为金黄色葡萄球菌61.3%(19/31)；凝固酶阴性葡萄球菌51.2%(43/84)。见表2。

三、PC33复合板与D试验检测克林霉素诱导耐药的结果比较

经配对χ2检验，2种方法的检测结果差异无统计学意义(P>0.5)，并以D试验法为判断标准评估PC33复合板检测克林霉素诱导耐药的敏感性为95.1%，特异性为100.0%；2种表型试验金黄色葡萄球菌符合率为100.0%，凝固酶阴性葡萄球菌符合率为93.0%。见表2。在115株葡萄球菌中，D试验结果和PC33复合板诱导孔结果同时阳性59株；D试验结果阳性而PC33复合板诱导孔结果阴性3株；D试验结果和PC33复合板诱导孔结果同时阴性53株(其中MS表型29株、cMLS 24株)。

四、erm基因在不同菌株中的分布

检测ermA、ermC基因，发现cMLS耐药菌株主要为ermA；iMLS耐药菌株主要为ermC，见表3。PCR反应产物在琼脂糖凝胶中电泳，见图2、图3。

表2　PC33复合板及D试验耐药检出率

注：(a)为cMLS型；(b)为iMLS型

图1　克林霉素诱导试验

注：1为DL2000 Marker; 2、3为阴性样本；4~8为ermA基因阳性样本

图2ermA基因扩增片段电泳图

注：1为DL2000 Marker； 2~8为ermC基因阳性样本

图3ermC基因扩增片段电泳图

讨论

临床上葡萄球菌引起的医院感染有所上升，而大环内酯类、林可酰胺类等抗菌药物由于其组织渗透性强、口服效果好且对肾脏无不良反应等特点被应用于治疗该类细菌引起的感染[8]。在患者中发现，克林霉素耐药情况是高度易变的，如果经常使用，可造成iMLS的漏检，导致临床治疗失败，iMLS的耐药表型是红霉素耐药而克林霉素敏感，必须用D试验才能检测出来[9]。应用红霉素和克林霉素纸片进行的D试验首先由SWENSON等[10]倡导，该方法用于葡萄球菌属克林霉素诱导耐药的检测，操作简便，结果可靠。但红霉素和克林霉素的纸片间距对试验结果有较大影响[11]，2张纸片间距过大可导致假阴性[12]。由于D试验是用纸片扩散法进行检测，不适合临床大量样本作为常规药物敏感性试验。而PC33复合板克林霉素诱导孔使诱导型耐药检测实现自动化，简单易行，准确度高，本研究对其检测性能进行了评估。115株试验菌株中，D试验阳性62株，D试验耐药检出率分别为金黄色葡萄球菌61.3%、凝固酶阴性葡萄球菌51.2%。PC33复合板检测阳性59株，PC33复合板耐药检出率分别为金黄色葡萄球菌61.3%、凝固酶阴性葡萄球菌47.6%。本研究结果表明，以D试验为判断标准计算PC33复合板检测克林霉素诱导耐药的敏感性为95.1%，特异性为100.0%；2种表型试验金黄色葡萄球菌符合率为100.0%，凝固酶阴性葡萄球菌符合率为93.0%。2种方法有很好的一致性，这与傅石明[13]的结果基本一致。在纸片法红霉素与克林霉素同时耐药的24例中，PC33复合板诱导孔未生长但红霉素孔耐药、克林霉素孔敏感，是否与PC33复合板对克林霉素的检测能力不稳定，或与操作人员处理菌液浓度是否均匀有关，有待进一步研究。

葡萄球菌对大环内酯类耐药通常有2种机制：一是由msrA基因(仅影响大环内酯类和链阳菌素B)或由mefA、mefE基因(仅影响大环内酯类，不影响克林霉素和链阳菌素B)介导的主动流出的泵机制，编码产生外排蛋白导致对大环内酯类和链阳霉素B的耐药，但对克林霉素敏感，这种耐药表型称为MS表型，即红霉素耐药而克林霉素敏感，这种能量依赖泵能在药物与核糖体靶位结合前有效地从菌细胞内排出大环内酯类药物。二是核糖体靶位改变，由各种erm基因编码的核糖体甲基化酶所介导，核糖体上单个位点发生变化，23S rRNA 上腺嘌呤残基N6 -二甲基化，导致核糖体构象发生变化，表现为对大多数MLS抗菌药物耐药。这种耐药体外可有2种表型，即cMLS和iMLS。若erm基因稳定表达，则表现对红霉素、克林霉素和其他MLS群成员耐药，称为MLS固有表型，即红霉素耐药且克林霉素耐药，常规的体外药物敏感性试验均能测出。然而在某些情况下，基因需药物诱导剂诱导才能表达对克林霉素耐药，否则体外可能会表现为对克林霉素敏感，红霉素可作为这种诱导剂，这些分离菌在体外表现对红霉素耐药而对克林霉素敏感，称为MLS诱导表型,即红霉素耐药而克林霉素敏感(诱导耐药)。目前，在葡萄球菌中发现了3种erm基因，即ermA、ermB和ermC，ermA和ermC比较常见，ermA+ermC是MLS葡萄球菌较为常见的复合基因型，而ermB较少见，主要从动物分离菌株中检测到。本试验对ermA、ermC进行了研究。

在115例试验菌株中，29株MS表型的菌株未检出任何基因型。12株iMLS耐药的金黄色葡萄球菌菌株中，8株基因型为ermA，4株基因型为ermC，未检出同时带有2种基因的菌株；50株iMLS耐药的凝固酶阴性葡萄球菌菌株中，11株基因型为ermA，38株基因型为ermC，1株检出同时带有2种基因的菌株。11株cMLS耐药的金黄色葡萄球菌中，8株基因型为ermA，1株基因型为ermC，1株检出同时带有2种基因的菌株，1株未检出任何基因型；10株cMLS耐药的凝固酶阴性葡萄球菌菌株中，5株基因型为ermA，1株基因型为ermC，2株检出同时带有2种基因的菌株，2株未检出任何基因型。由此可见，PC33复合板对克林霉素诱导型耐药有较小的漏检率。本研究中，cMLS耐药菌株的主要耐药基因为ermA，iMLS耐药菌株的主要耐药基因为ermC,这同乔昀等[14]的报道基本一致。

试验中3株菌株(其中1株为金黄色葡萄球菌，2株为凝固酶阴性葡萄球菌)未发现以上2种基因的任何1种，其表型为红霉素和克林霉素均耐药，耐药机制是否与携带其他基因如ermB、msrA(编码大环内酯类和链阳菌素共同耐药基因)和msrB基因等有关，有待进一步研究。iMLS型耐药在临床上比较多见，主要耐药基因为ermC，PCR可进行分子流行病学调查。目前临床微生物实验室使用PC33复合板进行克林霉素诱导耐药的检出率较高，能较好地指导临床合理使用克林霉素治疗。

参考文献

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(本文编辑：姜敏)

张静华，袁应华，刘妍，成洁，孙奋勇

(同济大学附属第十人民医院，上海 200072)

摘要：目的评价MicroScan革兰阳性复合板(简称PC33复合板)和D试验(红霉素、克林霉素双纸片法)检测葡萄球菌诱导型克林霉素耐药的性能及耐药基因分析。方法检测115株PC33复合板检测结果为红霉素耐药而克林霉素敏感的葡萄球菌对红霉素/克林霉素复合孔的耐药性，同时用D试验检测红霉素对克林霉素的诱导耐药表型，用聚合酶链反应(PCR)检测大环内酯类-林可酰胺类-链阳霉素B类复合药物(MLS)的耐药基因。结果PC33复合板耐药检出率分别为金黄色葡萄球菌61.3%、凝固酶阴性葡萄球菌47.6%，D试验耐药检出率分别为金黄色葡萄球菌61.3%、凝固酶阴性葡萄球菌51.2%，2种方法的检测结果差异无统计学意义(P>0.5)。以D试验为判断标准计算PC33复合板检测克林霉素诱导耐药的敏感性为95.1%，特异性为100.0%；检出erm基因常见的结构型MLS(cMLS)耐药基因ermA和诱导型MLS(iMLS)耐药基因ermC。结论PC33复合板与D试验检测葡萄球菌诱导型克林霉素耐药的结果有很好的一致性；PC33复合板有较好的临床应用价值。实验室应加强克林霉素诱导耐药的检测，以指导临床合理选用抗菌药物。

关键词：诱导型克林霉素耐药；葡萄球菌；MicroScan革兰阳性复合板；D试验；红霉素；基因

Drug resistance evaluation and gene analysis on the detection of inducible clindamycin resistance inStaphylococcusby 2 phenotype testsZHANGJinghua，YUANYinghua，LIUYan，CHENGJie,SUNFenyong.(TheTenthPeople′sHospitalofTongjiUniversity，Shanghai200072，China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the drug resistance performance and drug resistance gene on the detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus by MicroScan Gram-positive composite plate(PC33 composite plate)and D test(erythromycin and clindamycin double-disk diffusion method). MethodsThe drug resistance of erythromycin/clindamycin composite well of the 115 isolates which were resistant to erythromycin and sensitive to clindamycin by MicroScan automatic identification was determined. Meanwhile， the inducible resistant phenotype of erythromycin to clindamycin was analyzed by D test， and the resistant gene to macrolide-lincosamide-streptogramin B (MLS) was detected by polymerase chain reaction(PCR). ResultsThe detection rates of PC33 composite plate were 61.3% for Staphylococcus aureus and 47.6% for coagulase-negative Staphylococcus. The detection rates of D test were 61.3% for Staphylococcus aureus and 51.2% for coagulase-negative Staphylococcus. The difference between the 2 methods had no statistical significance(P>0.5). Using D test as a standard to evaluate PC33 composite plate resistant to inducible clidamycin resistance， the sensitivity was 95.1%， and the specificity was 100.0%. The predominant gene for constitutive MLB(cMLS) resistance to clindamycin was ermA. The predominant gene for inducible MLS(iMLS)resistance to clindamycin was ermC. ConclusionsThe detection results of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus by MicroScan Gram-positive composite plate show a coincidence with D test. PC33 composite plate has good clinical significance. The detection of inducible clindamycin resistance should be paid attention in laboratories in order to guide physicians to select antimicrobial agents correctly.

Key words:Inducible clindamycin resistance；Staphylococcus；MicroScan Gram-positive composite plate；D test；Erythromycin；Gene

收稿日期：(2014-12-15)

通讯作者：孙奋勇，联系电话：021-66306909。

作者简介：张静华，女，1984年生，学士，技师，主要从事临床微生物检验工作。

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)12-1238-05R446.5

文献标志码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.12.018