松江鲈脾组织细胞的短期培养及染色体分析

单莉娟,向阳，李霞,王茂林,秦艳杰,吴迪,白丽雯

(大连海洋大学 辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023)



松江鲈脾组织细胞的短期培养及染色体分析

单莉娟,向阳，李霞,王茂林,秦艳杰,吴迪,白丽雯

(大连海洋大学 辽宁省海洋生物资源恢复与生境修复重点实验室，农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023)

摘要:采用组织块法对体质量为120~140 g的松江鲈Trachidermus fasciatus脾组织细胞进行短期培养并对染色体进行了分析。结果表明:在pH为7.2、温度为25 ℃的条件下，松江鲈脾组织细胞在含有20%南美胎牛血清(FBS)、人碱性成纤维样细胞生长因子(bFGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)的培养基中，生长良好，迁出细胞有悬浮和贴壁两种形式；悬浮细胞为圆形和椭圆形，贴壁细胞呈变形细胞样和成纤维细胞样；利用悬浮细胞进行的染色体分析显示，松江鲈的染色体数2n=40，核型公式为14m+10sm+16t。本研究结果为松江鲈脾组织细胞系的构建奠定了基础，并初步建立了利用短期培养的脾组织细胞制备染色体的方法。

关键词:松江鲈；脾组织；体外短期培养；染色体

细胞系是病毒学、细胞毒理学、细胞工程、遗传学和肿瘤学等重要的体外研究体系。1962 年,Wolf 等[1]建立了第一个鱼类细胞系——虹鳟生殖腺细胞系RTG-2后，鱼类的细胞培养研究进展迅速，现已报道的鱼类细胞系有近300个，中国迄今建立的鱼类细胞系大约有70多种，主要来自鱼类的吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、鳔、性腺、肝脏、胚胎(囊胚、原肠胚等) 、鳍条、鳃盖膜等[2]，对脾组织细胞体外培养的报道仅见大泷六线鱼Hexagrammosotakii[3]、半滑舌鳎Cynoglossussemilaevis[4]、鲈Lateolabraxjaponicus[5]等。

松江鲈Trachidermusfasciatus又名四鳃鲈，隶属于鲉形目Scorpaeniformes、杜父鱼科Cottidae、松江鲈属Trachidermus，为小型、底层、肉食、降海溯河性洄游鱼类，其分布于日本、朝鲜，以及中国自北向南多个临近海淡水江河下游广大地区[6-8]，是中国渤海、黄海、东海沿岸及其相邻淡水水域的习见鱼类，以其肉味鲜美和体态多变，被誉为“中国四大名鱼”之一[9]。1988年，在中国《国家重点保护动物名录》中，松江鲈已被列为国家二级保护对象[7]。目前，对松江鲈生物学的研究主要集中在发育学、遗传多样性和基因等方面[10-12]，尚未见其细胞体外培养成功的报道。

鱼类染色体常规的制作方法是采用活体低渗滴片法，该方法不易获得较多的分裂相。用短期培养的细胞进行染色体制备的报道较少，刘博等[13]采用泥鳅Misgurnusanguillicaudatus鳍细胞进行染色体制备获得较好的分裂相，朱香萍等[14]利用短期培养的牙鲆Paralichthysolivaceus外周血淋巴细胞制备染色体同样也获得较好的分裂相。本研究中，利用体外短期培养的悬浮脾组织细胞，进行染色体制作和分析，以期为鱼类染色体的制备提供一种新的方法。

1材料与方法

1.1材料

试验用松江鲈取自大连市大刘家镇海域，全长为12~15 cm，体质量为120~140 g。取回后暂养于大连海洋大学北方海水增养殖重点实验室，暂养海水水温为23 ℃，盐度为25。

试验用DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)均为Hyclone公司产品；人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、Ⅰ型胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)均为Peprotech公司产品；硫酸软骨素为Wolsen公司产品。秋水仙素、甲醇、乙酸、Giemsa染料、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、甲酸等均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1脾细胞原代培养的启动参照郭莹等[15]对大泷六线鱼原代培养的方法，略有改动。将经高双抗消毒海水(含青霉素1000 IU/mL、链霉素1000 μg/mL)暂养24 h的鲜活松江鲈放置在无菌室内的超净工作台上，延脑处死后取其脾组织于无菌的青霉素小瓶中，用PBS和5% FBS-DMEM/F12各漂洗两次，将组织块剪成1 mm3碎块。用5% FBS-DMEM/F12培养基充分悬浮并接种于25 cm2培养瓶中。10 h后，补加培养基至5 mL/瓶。于25 ℃ 的CO2培养箱中培养，每7 d更换一次培养液，在OLYMPUSCKX41显微镜下观察并拍照。

1.2.2脾组织细胞的染色体制作与分析参考Wang等[16]的方法并稍加改动。收集原代培养10 d的脾组织悬浮细胞，放入培养瓶中培养2 d，加入秋水仙素，使其终浓度达到1 μg/mL，于25 ℃下继续培养4～6 h后，收集培养液于离心管中，以1000 r/min离心10 min后弃上清。用0.075 mol/mL KCl溶液25 ℃下低渗30 min，以1000 r/min离心5 min。用Carnoy液固定3次，每次15 min，并放入冰箱内冷冻过夜。采用冷滴片法滴片，室温下自然干燥。用Giemsa染液染色30 min，自然干燥。在Leica显微镜下观察，统计其染色体数目并拍照。

2结果与分析

2.1松江鲈脾组织细胞短期培养的生长情况

松江鲈脾组织块接种到细胞培养瓶24 h后，多数贴壁牢固。72 h后有细胞从组织块中迁出，呈悬浮和贴壁生长(图1-A)。10 d后组织块周围迁出细胞数量增加，贴壁细胞形成生长晕，悬浮细胞分层生长(图1-B)。37 d后，贴壁细胞基本长满培养瓶底，细胞类型趋于单一，主要为成纤维细胞样细胞(图1-C)。悬浮细胞由于换液，在原瓶中数量很少。

培养过程中脾组织共迁出4种细胞，分别为悬浮的圆形细胞和椭圆形细胞以及贴壁的变形细胞样细胞和成纤维细胞样细胞。培养初期，两种悬浮的细胞数量较多(图1-D)。其中，圆形细胞较其他细胞体积较小，细胞核体积较大且视野下非常明亮，培养早期数量增加很快；椭圆形细胞，体积较圆形细胞大，细胞核明显，数量较圆形细胞少。培养7 d后，迁出的椭圆形细胞数量明显减少，培养15 d后，迁出的圆形细胞数量也逐渐减少。培养7 d后，变形细胞样和成纤维细胞样两种形态的细胞迁出，变形细胞样细胞数量较多，成纤维细胞样细胞数量较少。呈变形细胞样的细胞，大小不一，形状不规则，细胞中有大量圆形小泡结构，既有聚集生长，也有单细胞生长，这种类型的细胞随换液过程细胞数量逐渐减少(图1-E)。成纤维样细胞聚集生长时，细胞镶嵌排列(图1-F)，常出现重叠现象；细胞分散生长时，突起较多，形状不规则，细胞核周围有颗粒状结构。细胞培养37 d后，原瓶中成纤维样细胞占据优势，变形细胞样细胞数量较少。至60 d时，显微镜下基本观察不到变形细胞样细胞。成纤维样细胞存活时间最长，经过一次传代后细胞仍然可以较好地贴壁生长。将早期换液中的悬浮细胞吸出，单独培养，发现椭圆形细胞数量几乎没有增加，但圆形细胞数量有增加并成团聚集生长，染色体分析可获得大量分裂相。但培养2周后再做染色体分析很难找到分裂相。说明细胞分裂能力减弱或丢失。

2.2染色体分析

对100个图像清晰、分散较好的中期分裂相细胞的染色体进行统计计数，结果发现，染色体数分布从35到42不等，其中染色体众数为40的细胞占全部计数细胞的53%(图2)。核型公式为14m+10sm+16t，臂数为62(图3)，即松江鲈脾细胞有7组中部着丝点染色体(m)，5对亚中部着丝点染色体(sm)，6对端部着丝点染色体(t)。

3讨论

3.1松江鲈脾组织细胞原代培养及细胞类型分析

在鱼类细胞培养中，常使用的培养基有DMEM/F12、DMEM和L-15等。本研究中参考大泷六线鱼鳍、吻端、肾组织原代培养[15]的方法，在松江鲈脾组织细胞培养过程中使用含20%FBS的DMEM/F12培养基，与魏云波[17]建立的褐点石斑鱼Epinephelusfuscoguttatus3种细胞系、樊廷俊等[18]报道的大黄鱼Pseudosciaenacrocea鳍细胞系采用的最适培养基相同。

关于鱼类脾组织细胞类型的研究不多，王文君等[3]在对大泷六线鱼脾脏细胞学的研究中发现5种细胞，即淋巴细胞、红细胞、巨嗜细胞、基质细胞和类内皮细胞。本研究中,在对脾组织细胞体外培养的研究中发现4种细胞，即圆形和椭圆形2种悬浮细胞以及变形细胞样和成纤维细胞样2种贴壁细胞。圆形细胞和椭圆形细胞其形态和游离状态与大泷六线鱼的淋巴细胞和红细胞的形态相似，而变形细胞样细胞大小不一，形态多变，与巨噬细胞形态相似；成纤维样细胞可单独存在，也聚集生长，细胞聚集时交叉排列，形成网状结构，可能与王文君等[3]报道的基质细胞相似。由此推断，本研究中的4种细胞分别为淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞和基质细胞，而类内皮细胞未发现，可能与这类细胞数量少、分裂慢有关。

注：A大量细胞从组织块迁出(3 d)；B组织块周围长满单层(10 d)； C细胞长满单层(37 d)；D实箭头示悬浮的圆形细胞，空箭头示悬浮的椭圆形细胞(4 d)；E箭头示变形细胞样细胞(7 d)；F箭头示成纤维细胞样细胞(7 d)Note:A, the explant and outgrowth of a large number of cells(3 d); B, a monolayer cells surrounding tissue(10 d); C, showing the monolayer of cells(37 d); D, showing suspension of round cells and suspension of oval cells(4 d); E, arrows showing deformation-like cells(7 d); F, arrows showing fibroblast-like cells(7 d)图1　松江鲈脾组织原代培养细胞Fig.1　Primary cultured cells of spleen in roughskin sculpin

图2　松江鲈脾细胞染色体数量分布图Fig.2　Number frequency of chromosomes in spleen cells of rough skin sculpin

图3　松江鲈脾细胞的中期分裂相图Fig.3　Metaphase chromosomes of spleen cells from roughskin sculpin

3.2利用短期培养的松江鲈脾组织细胞进行核型分析的可行性

对鱼类染色体的研究中，利用原代培养和早期培养的细胞进行染色体分析的报道不多。原代培养的细胞从组织块迁出，染色体无变异，是适合染色体分析的良好材料，但存在原代培养细胞数量少、增殖较慢的问题。本试验中，在脾组织原代培养中发现了极易从组织块中迁出的数量较大的呈悬浮生长的类淋巴细胞，在培养早期有明显的分裂能力，收集后用于做染色体分析，可以获得大量的分裂相。因此，将鱼类脾组织短暂的进行体外培养后，利用类淋巴细胞进行染色体制备，是鱼类染色体制作的一个良好方法。

较早的有关松江鲈染色体分析的报道显示，松江鲈染色体数目2n=40，与本试验中得到的结果相同，但臂数分别为NF=64、NF=60[19]，与本试验中核型公式14m+10sm+16t，NF=62不尽相同。引起这种差别的原因，可能是由于松江鲈生活的地区和取样时间不同造成的。

李树深[20]指出，在特定的分类类群中，具有较多端部着丝粒染色体的种类为原始类群，而具有较多中部或亚中部着丝粒染色体的是特化类群；染色体臂数多的类群体比染色体臂数少的类群特化，同属于杜父鱼科的绒杜父鱼Hemitripterusvillosus染色体数目2n=46，核型公式20m+16sm+10t,NF=82[19]。松江鲈的中部和亚中部着丝粒少于绒杜父鱼，端部着丝粒多于绒杜父鱼，说明松江鲈是杜父鱼科中较早出现的一种鱼类。

参考文献：

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Primary culture of spleen and karyotype analysis

in roughskin sculpinTrachidermusfasciatus

SHAN Li-juan, XIANG Yang，LI Xia, WANG Mao-lin, QIN Yan-jie, WU Di,BAI Li-wen

(Key Laboratory of Marine Bio-resource Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province, Key Laboratory of Mariculture & Stock Enhancement in North China’s Sea, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

Abstract：Primary culture of spleen and karyotype analysis wre performed in roughskin sculpin Trachidermus fasciatus with body weight of 120-140 g by a tissue explanting method. The results showed that the optimal growth of spleen cells in roughskin sculpin was observed in the culture medium of DMEM/F12 supplemented with 20% FBS of basic fibroblast growth factor(bFGF), insulin-like growth factor-Ⅰ(IGF-Ⅰ)and chondroitin sulfate at 25 ℃ and pH 7.2. There were two types of growing spleen cells, round and oval suspended cells and cell-like and fibroblast-like adherent cells. The analysis of suspended cells revealed that roughskin sculpin had a diploid chromosome number of 40, with karyotype formula 2n=40，and 14m+10sm+16t. The findings provided a useful foundation for the establishment of in vitro cell-line and the functional investigation in roughskin sculpin spleen，and the chromosome preparation method was preliminarily established using cells of the spleen in roughskin sculpin.

Key words：Trachidermus fasciatus; spleen; cell primary culture; chromosome

通信作者：李霞(1961—)， 女， 教授。E-mail:lx@dlou.edu.cn

作者简介：单莉娟(1989—)， 女， 硕士研究生。E-mail:xdykx@126.com

基金项目：辽宁省科技厅攻关项目(2011215002)

收稿日期：2014-05-27

中图分类号：S965.211

文献标志码：A

文章编号：2095-1388(2015)02-0161-04

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.009