兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因的克隆及组织表达分析

韩英，陈晓婷，王琨，张红

(1.东北农业大学 动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；3.哈尔滨商业大学，黑龙江 哈尔滨 150028)



兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因的克隆及组织表达分析

韩英1、2，陈晓婷1、2，王琨3，张红1、2

(1.东北农业大学 动物科学技术学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；3.哈尔滨商业大学，黑龙江 哈尔滨 150028)

摘要:为研究H-FABP基因在兴凯湖野生和养殖翘嘴鲌Culter alburnus 各相同组织中表达的差异，根据GenBank中已知鲤科鱼类的H-FABP基因序列进行引物设计，采用RT-PCR和RACE方法克隆出兴凯湖翘嘴鲌心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的全CDS区序列(402 bp)、3′UTR区序列(242 bp)和5′UTR区序列(134 bp)共778 bp的cDNA序列。将其提交到GenBank中，获得基因登陆号为KJ629286,通过Blast比对发现，兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因的CDS区与鲤Cyprinus carpio和齐口裂腹鱼Schizothorax prenanti的同源性高达91%；氨基酸同源性比对显示，兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列与虹鳟Oncorhynchus mykiss的同源性为76%，与斑马鱼Danio rerio的同源性为85%;分析野生翘嘴鲌7个组织(鳃、心脏、肠、肝胰脏、肌肉、肾脏、脾脏)以及养殖翘嘴鲌除心脏之外的6个相同组织H-FABP基因的表达情况，结果显示,H-FABP基因在野生组和养殖组肝胰脏中表达量均为最高，与其他组织的表达量有显著性差异(P<0.05)，H-FABP基因在野生组和养殖组各相同组织中的表达量无显著性差异(P>0.05)。研究表明，兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因序列高度保守，与鲤形目鱼类的同源性更高。

关键词:翘嘴鲌；兴凯湖;心型脂肪酸结合蛋白；基因克隆；组织表达

肌内脂肪(IMF)含量是反映鱼类肉质品质的重要指标，脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein，FABP)基因作为影响肌内脂肪含量的候选基因之一，在脂肪酸转运和脂类代谢中起着重要的作用，已引起学者的广泛关注。目前，已从哺乳动物、禽类、鱼类和昆虫等生物细胞液中分离出多种类型的FABPs，如脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)、脑型脂肪酸结合蛋白(B-FABP)、表皮型脂肪酸结合蛋白(E-FABP)、心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、小肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP)、回肠型脂肪酸结合蛋白(IL-LBP)、肝胰脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、髓磷脂型脂肪酸结合蛋白(M-FABP)和睾丸型脂肪酸结合蛋白(T-FABP)[1]。其中,L-FABP能同时结合长链脂肪酸，而IL-LBP对脂肪酸没有亲和力，I-FABP在与配基发生结合的过程中其构象与其他类型的FABP构象不同。近年来，对B-FABP和E-FABP的研究较多，人类B-FABP氨基酸序列与其H-FABP氨基酸序列具有67%的同源性，而人类E-FABP氨基酸序列与其H-FABP氨基酸序列则有48%的同源性[2]。

在畜禽类FABPs基因家族中，对H-FABP的研究比较广泛，多集中在多态性方面，而有关鱼类H-FABP基因及其表达的研究报道尚少。Ando等[3]克隆了虹鳟OncorhynchusmykissH-FABP基因，与鼠心型脂肪酸结合蛋白的同源性为75%。Liu 等[4]描述了斑马鱼DaniorerioH-FABP基因结构，并将该基因定位在连锁群上。Jordal等[5]测定了饲料脂肪酸对大西洋鲑SalmosalarH-FABP基因的影响，并分析了该基因在大西洋鲑不同生长阶段的表达情况。林亚秋等[6]克隆了齐口裂腹鱼Schizothoraxprenanti和鲤CyprinuscarpioH-FABP基因序列，并测定了该基因在各个组织中的表达量。覃川杰等[7]克隆了瓦氏黄颡鱼PelteobagrusvachelliH-FABP基因cDNA序列，定量PCR反应分析表明，腹腔脂肪组织是心型脂肪酸结合蛋白表达的主要场所。俞菊华等[8]对建鲤H-FABP基因分离及其多态性与增重的相关性进行了分析，检测了其中3个SNP位点的基因型，并筛选出与增重相关的分子标记。在GenBank中已经收录了鲤、斑马鱼、齐口裂腹鱼、虹鳟、罗非鱼Oreochromisniloticus、大西洋鲑、底鳉Fundulusheteroclitus、银鳕鱼Anoplopomafimbria等鱼类的H-FABP基因cDNA序列。

兴凯湖翘嘴鲌Culteralburnus体色银白、肉质细嫩、味道鲜美，是中国重要的名贵经济鱼类，也是古时历代进京贡品和高级宴席佳肴，具有极高的经济价值，是中国四大名淡水鱼之一。迄今为止，尚无其肉质性状与基因调控的相关报道。本研究中，以野生和养殖兴凯湖翘嘴鲌为试验材料，利用PCR技术和RACE法克隆H-FABP基因，进行序列分析、比对，并应用RT-PCR技术分析该基因在不同组织中的表达规律，探索兴凯湖翘嘴鲌肌内脂肪含量的调控机制，为进一步研究鱼类的肉质奠定基础，同时为其分子遗传育种提供参考依据。

1材料与方法

1.1材料

试验用野生翘嘴鲌采自黑龙江省兴凯湖，养殖翘嘴鲌采自黑龙江农垦振达兴凯湖大白鱼研究所养殖基地，体质量为(142.1±6.3)g，野生组和养殖组翘嘴鲌样本均为5尾，每组设3个重复。

感受态细胞、DNATaq酶、dNTP、Buffer、DNA Marker等试剂，均购自北京全式金生物技术有限公司。RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒，均购自海基生物科技有限公司。3′-Full RACE Core Set 2.0试剂盒、5′-Full RACE试剂盒、PMD18-T Vector试剂盒和荧光定量试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2方法

1.2.1样品的制备使用无RNA酶处理的手术刀和剪刀进行解剖，采集鲜活鱼体的肝胰脏、心脏、脾脏、肠、肌肉、肾脏和腮，迅速置于液氮中，于超低温冰箱(-80 ℃)中保存备用。

1.2.2H-FABP基因cDNA的克隆提取翘嘴鲌心脏组织RNA，使用紫外分光光度计以及琼脂糖凝胶电泳检测RNA。OD260 nm/OD280 nm值在1.8~2.0之间，而且凝胶成像显示分别在28 S、18 S、5 S三处有条带。用3 μg总RNA进行反转录，反应程序：30 ℃下反应5 min，42 ℃下反应30 min，95 ℃下反应5 min，共循环30次，4 ℃下保存。

参考已发表的鲤H-FABP基因序列(登录号：JQ342672.1)，使用Primer 5.0软件设计上下游引物H1；采用兴凯湖翘嘴鲌心脏组织的总RNA为模板并扩增出部分cDNA序列，根据其H-FABP基因部分CDS区序列设计RACE法扩增3′端和5′端所需的2对引物H3′和H5′(表1)，从而扩增出兴凯湖翘嘴鲌的H-FABP基因全cDNA序列。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，回收目的条带。将回收产物与PMD-18T载体连接，转化后筛选出阳性克隆，在NCBI上比对测序后的序列同源性。

表1　克隆H-FABP基因的引物

1.2.3H-FABP基因表达量的检测从心脏、肝胰脏、脾脏、肾脏、肠、鳃、肌肉各组织中提取总RNA，进行反转录。使用Primer 5.0软件设计FQ-PCR引物(表2)，采用FQ-PCR法检测H-FABP基因在各组织中的相对表达量。PCR反应程序:95 ℃下预变性15 s；95 ℃下变性5 s，60 ℃下退火34 s，共进行40个循环；60 ℃下延伸1 min。

表2　FQ-PCR引物

1.3数据处理

应用NCBI上的Blast程序，比对克隆出的序列与其他物种的同源性。使用DNAMAN软件拼接克隆出的cDNA序列。使用Mega 4.0软件进行碱基组成和变异分析并采用Neighbor-joining(NJ)法构建系统发育树。使用SPSS 17.0统计软件对表达量进行显著性检验。

2结果与分析

2.1翘嘴鲌H-FABP基因cDNA克隆及序列分析

注：起始密码子和终止密码子用方框标出Note：Initiation codon and termination codon are marked in a box图1　兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因全cDNA序列Fig.1　Complete sequence of cDNA of H-FABP gene in culter Culter alburnus in Xingkai Lake

采用RT-PCR和RACE法克隆并测序得到了翘嘴鲌H-FABP基因共778 bp的cDNA序列(图1)。该基因5′端非翻译区长134 bp，3′非翻译区长242 bp，起始密码子为 ATG，终止密码子为 TAA，PolyA加尾信号为 AATAAA。完整的开放阅读框由402 bp组成，编码133个氨基酸。将其提交到GenBank，获得基因登陆号为KJ629286。将所得氨基酸序列提交至NCBI，通过Blast比对氨基酸同源性，结果表明,兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列与齐口裂腹鱼、鲤同源性均为91%,与斑马鱼同源性为85%,与长鳍真鮰Ictalurusfunctatus同源性为83%,与大西洋鲑、虹鳟、银鳕鱼、底鳉等鱼类同源性为75%,与人Homosapiens、猪Susscrofa、牛Bostaurus、鸡Gallusgallus、大鼠Rattusnorvegicus、小鼠Musmusculus等哺乳动物和禽类的同源性为75%左右。兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸数目与鲤、斑马鱼、长鳍真鮰、大西洋鲑、虹鳟相同，均编码133个氨基酸,但比底鳉(编码132个氨基酸)多1个氨基酸，比银鳕鱼(编码134个氨基酸)少1个氨基酸。使用ClustalW在线比对，结果显示：仅在FABP胞质脂肪酸结合蛋白信号区其与齐口裂腹鱼和鲤有一个丝氨酸(S)突变成苏氨酸(T)的差异；与长鳍真鮰有一个从天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)的差异；与斑马鱼有2个氨基酸突变的差异，分别为丙氨酸(A)到甘氨酸(G)的突变和天冬氨酸(D)到谷氨酸(E)的突变。

2.2翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列的系统进化分析

将兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列与鲤、齐口裂腹鱼、斑马鱼、虹鳟、长鳍真鮰、银鳕鱼、大西洋鲑、底鳉、人、牛、猪、鸡、大鼠、小鼠的H-FABP氨基酸序列使用ClustalX 1.83软件进行多重比较分析，使用Mega 4.0程序中的Maxinum Parsimony和Neighbor-joining算法，设Bootstrap为1000，构建遗传进化树，结果如图2所示。从图2可见，兴凯湖翘嘴鲌首先与斑马鱼、齐口裂腹鱼和鲤聚在一起，然后与长鳍真鮰聚在一起，再与虹鳟和大西洋鲑聚在一起，最后与底鳉和银鳕鱼聚在一起，与其他鱼类、鸟类和哺乳类差异较大，分布在两个分支上。

图2　翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列的遗传进化树Fig.2　Phylogenetic tree of amino acid sequences in H-FABP in culter Culter alburnus

2.3H-FABP基因的组织表达

从图3可见：H-FABP基因在翘嘴鲌野生组和养殖组肝胰脏中表达量均为最高，与其他组织的表达量有显著性差异(P<0.05)；但野生组和养殖组各相同组织中的表达量均无显著性差异(P>0.05)。

注：标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)Note:The means with different letters are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters are not significant differences图3　翘嘴鲌H-FABP基因在各组织中的相对表达量Fig.3　Relative expression of H-FABP gene in tissues of culter Culter alburnus

3讨论

克隆新基因时，常选择亲缘关系相近物种的氨基酸序列保守区设计引物。经克隆、测序与比对分析，兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因全CDS区序列共402 bp，编码一个终止密码子和133个氨基酸。本试验中，将克隆得到的H-FABP氨基酸序列与其他物种H-FABP的同源性进行比较，结果显示，兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列与同属鲤形目的鲤和齐口裂腹鱼同源性高达91%，与非同目的斑马鱼同源性亦高达91%，与长鳍真鮰同源性达83%，与大西洋鲑、虹鳟、银鳕鱼、底鳉等鱼类同源性均在75%左右，与人、牛、小鼠、大鼠、猪、鸡等哺乳动物和禽类的同源性均为75%左右，由此可验证所得序列即为兴凯湖翘嘴鲌的H-FABP序列。兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸数目与鲤、斑马鱼、长鳍真鮰、大西洋鲑、虹鳟相同，均编码133个氨基酸；但比银鳕鱼(编码134个氨基酸)少1个氨基酸，比底鳉(编码132个氨基酸)多1个氨基酸。该序列具有高度保守性，这对于保持H-FABP的基本功能具有重要意义。

赵旭庭等[9]研究表明，H-FABP基因在鸭的脑和肾中有微量表达，在小肠、脂肪、腺胃、肌胃、骨骼肌和肺组织中均有中度表达，在心脏组织中表达量最高，在卵巢、脾和肝中不表达。在对鱼类H-FABP基因的研究中， Liu等[4]研究表明，H-FABP基因在斑马鱼卵巢和肝中表达最丰富，在心、脑、精巢、皮肤、肌肉、肠中均有不同程度的表达；林亚秋等[6]研究发现，H-FABP基因在齐口裂腹鱼和鲤肝胰脏中表达量最高，且表达量显著高于其他组织，在鲤各组织中表达量由高到低依次为心脏、脾、肾、脑、鳃、脂肪、肌肉，在齐口裂腹鱼各组织中表达量由高到低依次为心脏、脑、鳃、肾、肌肉、脂肪、脾。本研究中，对兴凯湖翘嘴鲌各组织的H-FABP基因mRNA相对表达量进行比较后发现，该基因在肝胰脏中的表达量显著高于其他组织，在肌肉、心脏、脾和肠中均有中度表达，在鳃和肾中仅有微量表达。动物的肝脏、脂肪组织和小肠是合成脂肪的主要场所，以肝脏的合成能力最强。已有研究表明，兴凯湖翘嘴鲌、鲤和齐口裂腹鱼H-FABP基因在肝胰脏组织中表达量均高于其他组织，说明其表达具有肝胰脏特异性。

H-FABP具有促进细胞内脂肪酸转运的功能，与长链脂肪酸的亲和力很强，其具有转运长链脂肪酸以及调节脂肪酸代谢平衡之功能[4，10]，可将脂肪酸运送到胞内脂肪及磷脂合成部位。研究表明，H-FABP基因与新疆细毛羊的IMF含量无相关性，与20～90日龄哈萨克羊的IMF含量呈显著正相关[11]；李文娟等[12]研究发现，H-FABP基因与矮脚鸡的IMF含量无相关性，与北京油鸡和白莱航鸡的IMF含量呈显著负相关；林亚秋等[6]测定了3种规格鲤和齐口裂腹鱼在不同饲养条件下相同繁殖周期内的IMF含量，并对H-FABP基因的表达量进行相关分析后发现，齐口裂腹鱼H-FABP基因表达量与IMF含量呈显著正相关，而鲤该基因表达量与IMF含量呈显著负相关，造成这种差异的原因，可能是由于两种鱼的脂肪转运与贮存分子调控机制以及生长环境不同。笔者在前期的研究中，对3龄、4龄、5龄兴凯湖野生和养殖翘嘴鲌的IMF和脂肪酸含量进行了分析，结果表明，在野生组中检测到18种脂肪酸，其中肌肉饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的总量显著高于养殖组(P<0.05)，随着年龄的增长，野生组肌肉脂肪含量显著低于养殖组[13-14]。本研究结果显示，H-FABP基因在野生组和养殖组各相同组织中的表达量无显著性差异。因此，H-FABP基因表达量与IMF的相关性具有物种差异性。鱼类脂肪代谢由多种基因共同协调作用，H-FABP作为肉质脂肪性状的候选基因之一，其对IMF含量的影响仍有待于进一步研究。

H-FABP作为影响肉质嫩度的主效基因，其多态性及分子标记尚需进一步研究。这对于了解鱼类肉质形成的分子机制，实现优质性状的早期选择，加快良种尤其是优良肉质鱼类的选择育种，具有重要的意义。

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Cloning and expression ofH-FABPgene in tissues of

culterCulteralburnusin Xingkai Lake

HAN Ying1,2, CHEN Xiao-ting1,2, WANG Kun3, ZHANG Hong1,2

(1.Animal Science and Technology College, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2. Country Location United Engineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding, Harbin 150030, China;3. Harbin University of Commerce, Harbin 150028, China)

Abstract：The 778 bp cDNA sequence including whole CDS sequence (402 bp), whole 3′UTR sequence (242 bp) and partial 5′UTR sequence (134 bp) of heart type fatty acid binding protein (H-FABP) in culter Culter alburnus was cloned by RT-PCR and RACE technology to evaluate difference between the amount of expression of H-FABP gene in wild and farmed culter in Xingkai Lake, according to the H-FABP gene sequences of members in Cyprinidae known in Genbank with accession number of KC782835. The Blast showed that there was 91% homology in H-FABP gene CDS area between culter and common carp Cyprinus carpio and prenant’s schizothoracin Schizothorax prenanti. The comparison of amino acid homology revealed that the H-FABP gene of the culter showed 76% homology with rainbow trout Oncorhynchus mykiss and 85% homology with zebrafish Danio rerio.The expression of H-FABP gene in 7 tissues (gill, heart, intestine, hepatopancreas, muscle, kidney, spleen) of wild Culter alburnus and in 6 tissues except heart of cultured culter indicated that the maximal mRNA expression of H-FABP gene was observed in hepatopancreas of wild and cultured culter, with significantly different from other tissues (P<0.05). In the same tissue, however, there was no significant difference in mRNA expression level of H-FABP gene in wild and cultured culter (P>0.05). It is concluded that the conservative H-FABP gene in culter had high homology with that in members in Cyprinidae.

Key words：Culter alburnus; Xingkai Lake; heart type fatty acid binding protein (H-FABP); gene cloning; tissues expression

作者简介：韩英(1963—)，女，教授，博士生导师。E-mail：hanying606@163.com

基金项目：黑龙江省博士后启动基金资助项目(LRB10-633(SN))；黑龙江省自然科学基金资助项目(C200934)

收稿日期：2014-06-20

中图分类号：Q78

文献标志码：A

文章编号：2095-1388(2015)02-0120-05

DOI：10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.002