L-型半胱氨酸通过抑制基质金属蛋白酶-9和-2活性缓解神经病理性疼痛

李佳婕 刘海娇 刘文涛 张广钦

L-型半胱氨酸通过抑制基质金属蛋白酶-9和-2活性缓解神经病理性疼痛

李佳婕 刘海娇 刘文涛 张广钦

目的本研究拟评估L-半胱氨酸通过抑制脊髓水平基质金属蛋白酶(MMP)-9和MMP-2活性,从而缓解神经病理性疼痛的可能性。方法通过测定动物机械学痛阈考察L-半胱氨酸对神经病理性疼痛的作用,同时用明胶酶谱法检测L-半胱氨酸对脊髓MMP-9和-2活力的抑制。结果L-半胱氨酸可以剂量依赖性地缓解大鼠慢性神经损伤模型诱导的机械学痛觉异常,并且在体外和体内均能显著抑制模型大鼠脊髓中MMP-9/2的活力。结论L-半胱氨酸可能通过抑制MMP-9和-2的活力来缓解神经病理性疼痛。

神经病理性疼痛； 基质金属蛋白酶 ；半胱氨酸

神经病理性疼痛被定义为躯体感觉神经系统的损伤所导致的疼痛［1］,它在临床上发病十分广泛,许多疾病都会导致神经损伤进而引发疼痛。现有治疗神经病理性疼痛的药物针对靶点多为神经元离子通道或神经递质,虽然有一定的镇痛疗效,但常会引起较严重的不良反应,极大的限制了其长期应用。

近年来,人们发现胶质细胞尤其是小胶质细胞和星形胶质细胞的活化引起的神经炎症在疼痛中起着极其重要的作用。MMP-9和-2属于明胶酶,有研究发现它们能够由胶质细胞合成并释放到胞外,通过促进炎症因子pro-IL-1β向成熟体IL-1β转化［2］诱导IL-1β的激活,并作用于神经元和胶质细胞上的相应受体激活下游信号通路,引起疼痛；MMP-9/2也能通过剪切细胞表面相关蛋白,促进神经元上N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)、α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑酸受体 (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor,AMPAR)等谷氨酸受体向膜上转运,进而增加神经元兴奋性［3］,导致疼痛。因此MMP-9/2已成为近来发现的治疗神经病理性疼痛的新靶点。然而至今还没有一个安全有效的MMP-9/2抑制剂能够应用于临床。因此,迫切需要寻找一种已经应用于临床,同时能有效的抑制MMP-9/2活性的药物,来治疗神经病理性疼痛。

MMP-9/2中有一个关键的结构——半胱氨酸开关,半胱氨酸残基的氧化是MMP激活的关键［4］。L-半胱氨酸为生物体内合成的含硫非必需氨基酸,在临床上作为重金属中毒的解毒剂,并用于治疗由于使用抗癌药物和放射性药物所引起的白血球减少症。本研究拟验证能否使用外源性L-半胱氨酸,作为一个半胱氨酸开关的类似物,保护MMP-9和MMP-2中半胱氨酸残基,抑制MMP-9/2的激活,从而缓解神经病理性疼痛。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物 L-半胱氨酸(生兴生物技术有限公司)。

1.2 动物 健康成年雄性SD大鼠,体重为180～220 g,由南通大学实验动物中心提供,实验动物使用许可证号：SCXK(苏)2014-0001。

1.3 仪器 足底测试仪(意大利UGO BASILE 公司)；电泳仪(美国Bio-Rad 公司)；化学发光仪(ChemiDoc XRS+,美国Bio-Rad 公司)。

1.4 方法

1.4.1 建立CCI诱导的神经病理性疼痛模型 大鼠坐骨神经慢性缩窄性损伤模型(chronic constriction injury,CCI):大鼠经水合氯醛(300mg/kg,腹腔注射)麻醉后,分离坐骨神经并宽松结扎,缝合肌肉层和表皮层。使用足底测试仪检测大鼠机械痛阈,以术后14 d大鼠机械痛阈下降＞40%为造模成功。假手术组以水合氯醛麻醉手术但不结扎神经。

1.4.2 观测CCI诱导的神经损伤大鼠机械学痛阈 采用足底测试仪观测大鼠的机械痛阈,具体方法如下：在安静、温度20～25 ℃的环境中,将大鼠置于透明的金属网格笼中,测定前使之适应20min,探觅行为停止后开始测量。以足底测试仪的平钝针尖刺激大鼠足底,由无压力逐渐缓慢加压至动物缩足,每次测量间隔3min,引起大鼠足爪抬起的最小压力为其机械性刺激缩足反射阈值。每只大鼠至少平行测量4次取平均阈值,并计算SEM值。

1.4.3 L-半胱氨酸对CCI 激活的MMP-9 和MMP-2的影响采用明胶酶谱法检测MMP-9/2的活力,具体操作如下：大鼠使用水合氯醛麻醉处死后取脊髓(L1～6),在1% NP40 裂解液中剪碎匀浆,提取上清,经过明胶琼脂糖凝胶4B提纯,加入上样缓冲液,涡旋混匀,在分离胶中加入1%的明胶,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,并对分离胶进行洗脱、孵育,用1%考马斯亮蓝染色,经脱色后,使用化学发光仪采集图像。

1.5 统计学方法 采用SPSS12.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 L-半胱氨酸对CCI诱导的神经损伤大鼠机械学痛阈的影响 实验动物分为五组,CCI模型组、CCI模型加半胱氨酸给药组(50、100、200mg/kg,灌胃给药)以及对照组(给予等体积生理盐水)。实验结果表明,在大鼠CCI 造模后第14天,与基础值相比,大鼠的机械痛阈由(13.54±0.40)g降至(5.13±1.30)g,表示模型成功建立。L-半胱氨酸能剂量依赖性的缓解CCI引起的痛觉异常,50、100、200mg/kg给药组灌胃给药2 h后CCI引起的神经痛模型大鼠的机械阈值与对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05),分别使CCI引起的神经痛模型大鼠的机械阈值上升到对照组的30.9%,44.7%和68.8%。见图1。

2.2 L-半胱氨酸对CCI 激活的MMP-9 和MMP-2的影响 实验结果显示L-半胱氨酸能在体内显著抑制CCI诱导的MMP-9/2的激活,50mg/kg的剂量抑制MMP-9和MMP-2的效率分别达到44.3%和25.5%。见图2A-2B。同时,L-半胱氨酸在体外也能够显著地直接抑制MMP-9/2的活力,10-5mol/L的L-半胱氨酸对MMP-9的抑制效率达到79.7%,对MMP-2的抑制效率达到75.6%。见图2C-2D。

3 讨论

明胶酶MMP-9和MMP-2,在神经病理性疼痛中有着至关重要的作用。MMP-9/2一方面能够通过促进pro-IL-1β向成熟体IL-1β转化［2］,活化的IL-1β通过作用于神经元上的IL-1受体激活下游信号通路,使神经元上N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)的激活,使钙离子内流增加,增强突触信号传导,进而引发疼痛［5］。另一方面,MMP-9/2还能够直接通过对NMDA受体功能性亚基NR-1以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)家族蛋白细胞外信号调节激酶(extracellular-signal- regulated kinases,ERK)的磷酸化直接增强神经元兴奋性,从而引起中枢敏化维持疼痛［6］。

半胱氨酸开关是MMP-9/2激活过程中一个关键的结构,它由MMP-9/2肽链中的半胱氨酸残基,与锌离子活性位点组成。一般情况下,两者结合,覆盖活性位点,MMP-9/2不能发挥酶活性。当半胱氨酸残基被氧化,与酶活性位点分离,MMP-9/2则被激活,发挥酶活性［7］。而L-半胱氨酸,作为体内一种还原性氨基酸,又是MMP-9/2中半胱氨酸残基的类似物,应当能够保护其半胱氨酸残基不被氧化,从而抑制它的激活。实验结果已证明,L-半胱氨酸能够在体外直接抑制CCI 诱导的MMP-9/2激活。

本研究还发现,L-半胱氨酸对于CCI 诱导的机械学痛觉异常有显著的缓解作用,同时L-半胱氨酸体内给药也能够显著抑制CCI造模所引起的MMP-9/2的激活,因此提示L-半胱氨酸可能通过抑制MMP-9/2活力来缓解疼痛。

已有报道发现,在阿尔兹海默症模型中,脑中MMP-9/2的表达增加,促进淀粉样-β肽降解,从而加速阿尔兹海默症的进展［8］,外源性给予L-半胱氨酸的衍生物对阿尔兹海默症也有一定缓解作用［9］。同样,镉中毒也能诱导MMP-9/2的高表达［10］,给予L-半胱氨酸可以有效保护神经细胞［11］。而有研究表明神经病理性疼痛时脊髓和DRG中MMP-9/2表达和活力均显著上调［2］,此次实验结果证明L-半胱氨酸可以抑制MMP-9/2活力,且能够有效的缓解疼痛症状,与上述研究相符合。

综上所述,L-半胱氨酸能够有效缓解神经病理性疼痛,并对其可能的机制,即抑制MMP-9和-2的活力,在体内和体外进行了考察。作者的研究为神经病理性疼痛的治疗提供了一种新的安全有效的药物,并为以半胱氨酸开关为靶点,调节MMP-9/2活力来开发新的镇痛药物提供了新的思路。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.07.212

2015-12-07］

210009 中国药科大学/临床药学教研室(李佳婕刘海娇 张广钦)；南京医科大学/江苏省神经退行性疾病重点实验室(刘文涛)

张广钦