慢病毒转染海马神经元的模型建立

于金鹏,　伍国锋,　王丽琨



慢病毒转染海马神经元的模型建立

于金鹏,伍国锋,王丽琨

目的建立一种简单易行的体外慢病毒转染海马神经元的实验方法。方法取怀孕的SD大鼠，分离体内胎鼠的海马后，经Accutase消化后接种，采用无血清培养海马神经元，选择合适的时间将慢病毒加入神经元内，于不同的时间在倒置荧光显微镜下观察细胞内GFP的显影效果。结果慢病毒转染海马神经元后，在第3天时观察，细胞内GFP在倒置荧光显微镜下显影达到80%以上。结论此方法简单易行，慢病毒转染神经元的成功率高，为慢病毒转染海马神经元后的后续实验奠定了实验基础。

海马；神经元；慢病毒；转染

海马神经元已经广泛地应用于神经系统的研究，包括神经元的发育分化、神经元再生、神经疾病的发生机制等方面。尤其是在神经系统疾病如AD、癫痫、脑血管疾病研究中更加突显其作用的重要性，在疾病的发生机制中，为了研究相关基因对蛋白的调控作用，往往借助携带目的基因的慢病毒转染海马神经元后，进行深入的研究。但是神经元的培养对于实验技术要求高，同时，由于神经元的生长代谢缓慢，体外存活时间短，对外界的环境变化敏感，故慢病毒转染海马神经元的难度增加。本实验建立了一种简单易行，慢病毒转染神经元的成功率高模型的实验方法，为慢病毒转染海马神经元后的后续实验奠定了实验基础。

1　材料与方法

1.1慢病毒和主要试剂孕19 d的SPF级SD大鼠(E19)(贵阳医学院实验动物中心提供)。Neurobasal®-A Medium (1X)、GlutaMAXTMSupplemen、B-27®Serum-Free Supplement (50X)、双抗(青霉素/链霉素)、胎牛血清均购自Gibco。DMEM/F12购自Hyclone。多聚赖氨酸、Accutase酶购自Sigma。Lentiviral vectors(上海吉凯基因)，Enhanced Infection Solution (上海吉凯基因)。

1.2海马神经元的培养紫外灯照消毒超净台及操作间，并将手术器械高压灭菌后备用。取出SD孕鼠，经10%水合氯醛麻醉后，解刨腹部，取出胎鼠，75%酒精清洗。用眼科剪刀断其头部剪开皮肤及颅骨，暴露双侧大脑半球，取出携带部分脑干的大脑组织，放入预冷的Hanks液培养皿中。用眼科无齿尖镊小心分开皮质，暴露并取出双侧海马组织，尽量去除残留的血管和脑膜，放入15 ml离心管中置于冰上。以上解剖应在1 h内完成。 用Hanks液清洗海马组织，加入5倍于海马组织体积的Accutase酶于37 ℃培养箱中消化10 min。当海马组织块体积明显减少时，终止液终止消化，加入种植液至3 ml。先用塑料巴斯德滴管吹打数次，至组织变小，再用火焰抛光的巴斯德滴管吹打3遍，用200目细胞筛过滤至另一个离心管内，得到细胞原液。经台盼蓝染色细胞计数，以5×105/ml细胞密度接种于24孔板中，置于37 ℃ CO2培养箱中培养。4 h后全量换液为饲养液培养，以后每周2～3次半量换液，在倒置显微镜下观察并拍照。

1.3海马神经元的鉴定一般在海马神经元培养至第7～14天时状态最佳，因此本实验选择在海马神经元培养至第7天时进行纯度鉴定，采用神经元特异性烯醇化酶 (NSE)抗体免疫组化染色技术。免疫组化染色结果的判断标准及方法：以胞质或突起染成棕黄色为阳性神经元。在高倍显微镜下随机选取5个视野，计数其阳性细胞的个数，重复5次，取其均值作为阳性神经元的百分率。

1.4慢病毒转染海马神经元按照上海吉凯公司的慢病毒手册，按照不同的感染复数(MOI),分别在海马神经元培养第1天、第7天时，进行慢病毒转染，24 h后更换为完全培养基培养，72 h后在通过倒置荧光显微镜观察细胞内GFP的表达，并用MTB2011 Configuration 2.2.0.6分析病毒转染效率。MOI分别选取5、10、15、20。

2　结　果

2.1神经元纯度的测定用 NSE对海马神经元进行鉴定， 所得阳性反应细胞的纯度为(86.32±1.48)%。

2.2慢病毒转染时间及转染效率的鉴定在海马神经元培养第1天、第7天时，分别进行慢病毒转染，并设计不同的MOI，72 h后在倒置荧光显微镜下观察GFP细胞内显影效果，观察海马神经元的转染效率。结果显示，在海马神经元培养第1天，及MOI=10时，慢病毒的转染效率达到最佳状态，可到达80%以上，可用于后续的实验。

3　讨　论

3.1原代海马神经元的培养一直以来神经元在原代培养中都是棘手的问题，选择胎鼠作为取材，提取细胞的活性好，易于后续的慢病毒转染神经元。笔者总结了如下经验:(1)实验从取材到接种完毕的时间一定控制在2 h内完成;(2)在海马神经元贴壁4 h后，立即进行全量无血清培养基换液，不仅尽早清除杂质，也降低神经元的分化[1～3];(3)在消化海马组织时，鉴于胰蛋白酶对细胞的毒性大，且消化时间和浓度不宜控制，故采用Accutase酶;(4)在抑制胶质细胞过度增殖方面，用无血清培养，添加了B27补充剂，促进神经元的成长，抑制了胶质细胞的生长。此实验方法可获得高纯度、高活力的海马神经元，操作简单，无需特殊设备。

3.2慢病毒转染海马神经元在神经系统疾病的发生机制研究中，往往借助于慢病毒携带目的基因来研究靶点蛋白的调控变化，但是多数考虑慢病毒转染神经元的效率低，采用细胞系代替，但本文提供慢病毒转染海马神经元的方法，也是简单易行，转染效率高，总结经验如下：(1)选择胎鼠海马神经元进行慢病毒转染；(2)转染时间的选择，在海马神经元培养第1天时为适宜;(3)转染时，不宜加转染增强剂，由于转染增强剂对神经元有毒性，不仅会引起细胞死亡，也会导致细胞变异。同时，采用Enhanced Infection Solution 作为缓冲稀释病毒液，进行无血清培养，双抗对于慢病毒的转染效率无关；转染24 h后换液，更换为无病毒的维持培养基饲养[4～8]。4 h、72 h后，在荧光显微下观察神经元内的GFP显影效率，在MOI=10时，可达到80%以上，通常荧光会持续2～3 d，在第6天时，GFP荧光开始消失。

本文的慢病毒转染海马神经元的方法简单，且效率高，为后续借助其研究海马神经元相关基因的调控机制，提供很好实验模型，同时也为进一步研究海马神经元的相关疾病提供了实验基础。

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Establishing model of lentivirus transfection of hippo-campal neurons

YUJinpeng,WUGuofeng,WANGLikun.

(EmergencyDepartmentofNeurology,TheAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

ObjectiveTo establish a simple and practical method of slow virus in vitro transfection method of hippocampal neurons.MethodsThe hippocampus were isolated from neonatal rat(1 d),and digested with accutase.Hippocampal neurons were planted and cultuted with serum-free neurobassal.The Lentivirus were added into the neurons at the appropriate time,then observe the enhancement effect of GFP in the cell at different timesIn the inverted fluorescence microscope.ResultsHippocampal neuron cultures are infected after 3 days in vitro by simply adding the amount of virus,and estimated to infect up to 80% of all neurons based on checking for fluorescent protein expression In the inverted fluorescence microscope.ConclusionsThe persent protocol is a simple and efficient method for lentiviral transfection of hippocampal neurons.

Hippocampus;Neurons;Lentiviral vectors;Transfection

1003-2754(2016)02-0161-02

2015-10-09；

2015-11-30

(贵州医科大学附属医院急诊神经内科,贵州 贵阳 550004)

伍国锋，E-mail:wuguofeng3013@sina.com

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