过敏性休克动物实验模型的进展

2016-01-25陈洁谢华

浙江医学 2016年8期

陈洁谢华

●综述

过敏性休克动物实验模型的进展

陈洁谢华

过敏性休克，亦称变态反应性休克，是指外界某些特异性变应原作用于已致敏的机体，引发全身性速发型变态反应；以急性呼吸及循环衰竭表现为主，可在短时间内累及多个脏器，甚至休克、死亡。过敏性休克发生突然，病情严重，若不及时处理常可危及生命，是所有过敏反应中发病最急、病情最严重的一种。因其突发性和不可预测性，无法进行人体大样本、随机、双盲对照研究，同时该病治疗药物的开发进展缓慢，到目前为止肾上腺素仍然是治疗的首选药物[1-2]，激素和抗组胺药的效果和应用时机存在争议[2-3]。因此，过敏性休克动物实验模型是我们研究过敏性休克发病机制及探讨有效治疗手段的主要方式，国内外学者已经建立了豚鼠、小鼠、大鼠和家兔等不同种属的动物实验模型，本文就近年来国内主要4种过敏性休克动物实验模型的进展作一综述，以期为相关研究的开展提供参考。

1 大鼠过敏性休克模型

近年来，建立大鼠过敏性休克模型的方法主要有2种：（1）以卵蛋白为过敏原腹腔注射致敏，尾静脉注射诱发过敏性休克；（2）以腹腔注射肥大细胞脱颗粒剂化合物48/80的方法直接诱发大鼠过敏性休克，主要用于药物及其成分的研究。

景丽霞等[4]以卵蛋白为过敏原建立过敏性休克大鼠模型，研究CD63表达在过敏性休克诊断中的应用价值，亦通过研究CD63表达来确定嗜碱性粒细胞活化。建模步骤如下：（1）实验开始以5%鸡卵清蛋白0.5ml和4%氢氧化铝佐剂0.2ml腹腔注射，致敏18d后通过尾静脉注射10%鸡卵清蛋白1ml诱发大鼠过敏性休克的发生。通过观察动物临床症状与尸体解剖结果来证明过敏性休克大鼠模型建立成功，实验组大鼠死亡率为25%，对照组为0%。该法操作简便，试剂获取容易，但大鼠休克死亡率低，实验动物浪费较大，因此，后期学者针对以上不足进行了改进，通过增加刺激次数来提高诱发过敏性休克的成功率。米丽等[5]在过敏性休克死亡后大鼠血清IgE、类胰蛋白酶的变化规律与死亡时间、尸体及样本保持环境的相关性研究中，通过多次腹腔注射过敏原增强免疫，提高了大鼠过敏性休克死亡率。实验过程如下：按体重给予过敏原，每100g体重给予10mg卵蛋白（溶于0.5ml生理盐水，氢氧化铝佐剂1∶1混合），分别于第1、3、5天腹腔注射给药1次/d，以增强免疫，第18天尾静脉注射10%卵蛋白1ml诱发。通过观察大鼠临床症状、尸体解剖组织形态学改变、肺组织甲苯胺蓝染色见肥大细胞脱颗粒等来证明过敏性休克大鼠实验模型建立成功，死亡率为71%，明显高于景丽霞等[4]建模结果，提示大鼠模型改良成功，低浓度、多次致敏期注射能有效提高模型死亡率。

以肥大细胞脱颗粒剂化合物48/80诱导的大鼠过敏性休克模型是另一建模方法，是近年来研究药物及其成分的常用造模方法。李晓洁等[6]通过建立以肥大细胞脱颗粒剂化合物48/80诱导的大鼠过敏性休克模型，检测VCAM-1在过敏性休克大鼠各器官中的表达及其变化，探讨VCAM-1在过敏性休克大鼠器官中的作用及表达规律。建模步骤如下：将化合物48/80稀释成质量浓度为0.5mg/ml的注射液，休克组每只大鼠腹腔注射4ml，建立过敏性休克动物模型。通过观察大鼠临床症状、尸体解剖、肺组织HE染色来证明建模成功，死亡率为100%。

此外，大鼠过敏性休克模型还以青霉噻唑蛋白作为过敏原致敏的建立方法，近年来较少采用。

2 豚鼠过敏性休克模型

豚鼠呼吸系统的免疫敏感性与人类相近，且豚鼠易于致敏，其过敏性休克模型在近年来采用较多，多人混合血清是豚鼠过敏性休克模型应用较为普遍的致敏原。该法完整的模型制备过程由任广睦等[7]首次报道，具体如下：以无菌生理盐水稀释后的多人混合血清作为过敏原注射液（1∶10），在豚鼠右侧后爪掌皮内注射0.15ml过敏原，致敏3周后心腔穿刺注入过敏原1ml来诱发过敏性休克。该法制备过敏原注射液过程简单，获取途径较多，且对经费要求不高，国内学者采用较多。王昌亮等[8]亦通过上述方法复制豚鼠过敏性休克模型。应用免疫组化染色、图像分析技术观察豚鼠过敏性休克死亡肺组织中类胰蛋白酶和胃促胰酶的表达情况；结果表明实验组肺组织中类胰蛋白酶和胃促胰酶阳性细胞明显增多，冷藏48h和冷冻7d对以上2种酶的表达无明显影响，可作为过敏性休克死亡的诊断依据。

该模型的建立对实验者心腔注射操作技术要求较高；此外，心腔注射的方式会增大豚鼠发生心脏压塞死亡的可能性，影响实验观察、动物过敏性休克死亡的发生率和结果的可信度。心腔穿刺对心肌损伤较大，而心肌组织内存有较多肥大细胞，心肌创伤后肥大细胞释放大量类胰蛋白酶入血，会影响相关实验血液类胰蛋白酶表达水平的测量结果。陈炯垣等[9]基于原实验存在的不足，进行了以多人混合血清为过敏原的豚鼠过敏性休克模型改良。改良模型的致敏原分为2种：致敏为1∶2稀释的混合人血清，诱发稀释比例为1∶20。致敏过程亦有所改变：分别于第1、3天在豚鼠双侧后爪掌皮内注射0.1ml过敏原稀释液（1∶2）；致敏后2周豚鼠后腿足背静脉穿刺注入1 ml过敏原稀释液（1∶20），诱发过敏性休克。结果提示改良模型的过敏反应死亡率明显提高，且豚鼠无心脏压塞现象，改良模型组血清中总 IgE和肥大细胞类胰蛋白酶含量均较对照组明显升高，差异有统计学意义；亦高于任广睦等[7]报道的方法。改良模型为研究血清总IgE、肥大细胞类胰蛋白提供了有效的实验动物模型，并受到国内学者的欢迎[10]。

近年来有报道以卵蛋白、生理盐水配制成的卵蛋白溶液为过敏原腹腔注射建立豚鼠过敏性休克动物模型。杨凯等[11]采用卵蛋白腹腔注射诱导豚鼠过敏性休克模型，观察白三烯E4、前列腺素D2、羧肽酶A3和血小板活化因子在过敏性休克死亡豚鼠体内的变化规律。建模步骤如下：将卵蛋白、生理盐水配制成2%卵蛋白溶液，将卵蛋白溶液与等体积弗氏完全佐剂充分混合成乳剂，在豚鼠左右后足掌内皮下各注射0.2ml乳剂，致敏后2周腹腔注射2%卵蛋白溶液2ml，建立豚鼠过敏性休克动物模型。通过观察动物临床症状及解剖后各组织器官改变来证明过敏性休克模型建立成功。

此外，国内外学者还建立了许多相关动物模型，但近年来均较少采用，如以天花粉蛋白注射液为过敏原腹腔注射致豚鼠全身过敏反应，以青霉噻唑蛋白致敏来诱发豚鼠过敏性休克。

3 小鼠过敏性休克模型

近年来，采用昆明种小鼠建立过敏性休克模型由薛少华等[12]首次提出。昆明种小鼠价格低廉，容易获得，操作简便，且可成批处理。该法以卵蛋白为过敏原建立小鼠过敏性休克模型，具体步骤如下：第1天腹腔注射卵蛋白0.25ml，1周后加强注射一次，免疫后第3周，尾静脉注射卵蛋白0.5ml，以诱发过敏性休克。通过观察诱发后动物临床症状、HE染色结果、肥大细胞脱颗粒计数结果等来证明模型建立成功，死亡率为22.5%。该法操作简单，资金要求低，可操作性强，近年来有较多学者开始采用[13]。

4 家兔过敏性休克模型

目前常见的家兔过敏性休克模型主要以多人混合血清为过敏原。程红霞等[14]通过建立家兔过敏性休克模型观察P物质在过敏性休克家兔胃肠道组织中随时间变化的规律，探讨其在过敏性休克中的作用。实验步骤如下：家兔皮下注射20%多人混合血清1ml，每隔1周加注一次，致敏3周后在耳缘静脉快速注入制备好的50%多人混合血清5ml，以诱发过敏性休克。通过观察实验动物临床症状、尸体解剖和HE染色结果来证明实验模型建立成功，动物死亡率达70%。该法是建立家兔过敏性休克模型的经典方法，已被多位学者采用[15]。

5 结论

为了探索诊断过敏性休克的敏感、客观指标以及开发治疗过敏性休克的药物，国内外学者建立了许多相关动物模型。制备过敏性休克模型的动物有很多种，豚鼠、家兔、大鼠、小鼠、猫、狗、牛、马、羊、猪和鸡等动物均可，其中豚鼠是目前过敏性休克和变态反应实验研究的首选动物。豚鼠繁殖周期短、易饲养，注入微量过敏原即可致敏，致敏后2～3周处于高敏状态且可维持6个月以上，其速发型变态反应与人相似，是免疫学研究方面首选的动物过敏反应模型。豚鼠过敏性休克模型是过敏性休克研究中的经典模型。但是，豚鼠价格昂贵，且受到商品化试剂的局限性，豚鼠过敏性休克模型的应用受到一定限制。小鼠和大鼠具有繁殖快、价格低、来源丰富、有关分子生物学试剂较多等优点，近年来已成为研究速发型过敏反应机制和IgE抗体应答的主要实验动物。但是，小鼠和大鼠也存在体积小、体重轻、操作不便等问题，因此，家兔逐渐进入研究者的视野。家兔体积大，性情温顺，易繁殖、饲养，耳静脉大而清晰、易进行抽血或注射，常被用来制备各种免疫血清或进行过敏反应的研究。

综上所述，用于建立过敏性休克模型的动物种类繁多，应根据实验目的、方法、资金、参与人员等因素综合考虑，选择适合建模的动物。在医疗行为中，过敏性休克没有诊断的“金标准”，学者通过动物实验进行临床症状观察、尸体解剖、组织染色、肥大细胞脱颗粒观察计数和血清IgE检测等进行诊断。本文总结国内普遍采用的过敏性休克动物模型，介绍其建模方法，旨在为从事相关研究的医学人员提供参考。

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