PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与PCOS的相关性研究

刘元伟 邓妙 岑加萍 张红艳 张治芬

●论 著

PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与PCOS的相关性研究

刘元伟 邓妙 岑加萍 张红艳 张治芬

目的 探讨纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）基因启动子区4G/5G多态性与浙江地区汉族多囊卵巢综合征（PCOS）发病、胰岛素抵抗及肥胖的关系。方法选择浙江地区汉族PCOS患者120例和健康对照者102例，分别测量两组身高、体重、腰围，并计算BMI和腰臀比；采用PCR技术检测两组PAI-1基因启动子区4G/5G多态性分布；采用ELISA法检测PCOS患者空腹胰岛素，采用葡萄糖氧化酶法检测PCOS患者空腹血糖，并计算胰岛素抵抗指数（Homa-IR）。再根据BMI、Homa-IR将PCOS患者分为肥胖组（54例）与非肥胖组（66例），以及胰岛素抵抗组（49例）与非胰岛素抵抗组（71例），分别比较两组基因型频率。结果PCOS患者组PAI-1基因启动子区4G/4G基因型频率明显高于健康对照组（P＜0．05）。PCOS患者PAI-1基因启动子区4G/4G基因型频率为胰岛素抵抗者、非肥胖者分别高于非胰岛素抵抗者、肥胖者（P＜0．05）。结论PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与浙江地区汉族PCOS发病、胰岛素抵抗及肥胖有关；其中4G/4G基因型可能是PCOS发病、PCOS患者胰岛素抵抗的危险因素，且可能影响非肥胖型PCOS患者病情发展。

多囊性卵巢综合征 纤溶酶原激活物抑制剂1 基因多态性胰岛素抵抗 肥胖

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种复杂的神经内分泌、代谢系统和卵巢局部调控因素异常的异质性疾病，主要病理生理机制是高胰岛素血症和胰岛素抵抗，在育龄期女性中发病率为4%～18%，在无排卵性不育症患者中发病率高达30%～60%[1-2]，临床上主要表现为不同程度的月经异常、不孕、多毛、痤疮、肥胖等[2-3]。PCOS确切病因尚未明确，有研究认为PCOS患者存在一定的血栓倾向，纤溶系统受损是重要原因，其中血浆纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）与PCOS发生、发展密切相关[4]。有研究表明PCOS患者PAI-1水平明显高于正常组。PAI-1是纤溶系统活性的主要调控者，是防止血栓形成的重要保护机制，在胰岛素抵抗状态下，高胰岛素血症与PAI-1水平升高、活性增强同时存在[4-5]。随着分子生物学技术的发展，研究发现PAI-1基因启动子区域一个碱基插入或缺失，均会影响PAI-1水平及活性，其中4G/ 4G基因型会升高PAI-1水平及活性，促进PCOS、糖尿病、冠心病和心肌梗死等心血管疾病的发生、发展[4-7]。本研究旨在探讨浙江地区汉族PCOS患者PAI-l基因启动子区4G/5G多态性与PCOS发病、胰岛素抵抗及肥胖的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2013年6月至2014年6月在杭州市第一人民医院妇科门诊就诊的PCOS患者120例为PCOS组；选择同期健康体检妇女102例作为健康对照组；PCOS诊断标准参照2003年欧洲人类生殖协会和美国生殖协会共同推荐的诊断标准[8]。PCOS组与健康对照组均排除高血压、下丘脑性闭经、卵巢肿瘤、感染和自身免疫性疾病；接受试验前3个月未使用影响生殖激素、胰岛素、血糖、血脂等药物，未实行计划性减肥，无手术及创伤史，无影响凝血功能改变的疾病；所有对象均为汉族，无亲缘关系。参照2000年WHO制定的亚太地区诊断标准（BMI≥25 kg/m2为肥胖），将PCOS患者分为肥胖组54例和非肥胖组66例。采用稳态模型胰岛素抵抗指数（Homa-IR）评估胰岛素敏感性（Homa-IR≥2.0为胰岛素抵抗），并将PCOS患者分为胰岛素抵抗组49例和非胰岛素抵抗组71例。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 采集空腹静脉血，离心，分别提取血浆和血细胞，分离血浆用于检测空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素（FINS），要求所有受试者在采血前晚低糖、低脂饮食，采血当日清晨空腹。

1.2.2 体格测量 测量身高、体重、臀围、腰围。BMI=体重/身高2；腰臀比=腰围/臀围。

1.2.3 生化检测 采用ELISA法检测FINS，采用葡萄糖氧化酶法检测FBG；均由我院中心实验室检测。

1.2.4 基因分析 （1）细胞DNA的提取：使用DNA纯化试剂盒（美国AXYGEN公司）抽提DNA；（2）PCR法目的片段扩增；（3）引物设计：参照文献设计PCR引物序列（上海辉睿生物科技有限公司），PAI-1基因启动子区引物序列：①5G引物：5′-GTCTGGACACGTGGGGG-3′；②4G引物：5′-GTCTGGACACGTGGGGA-3′；③共同下游引物序列：5′-CAGGTCACTGTGGAGTTATC-3′；④阳性对照上游引物：5′-AGCTTTTACCATGGTAACCCCTGGT-3′。4G和5G分别在2个反应体系中进行：一管加入引物①、③、④；另一管加入引物②、③、④。经PCR反应、琼脂糖凝胶电泳，电泳分型：含4G、5G的PCR产物长度均为135bp，阳性对照段PCR产物长为256bp，若只出现4G则为4G/4G基因型；只出现5G则为5G/ 5G基因型；4G、5G同时出现为4G/5G基因型。由于本研究5G/5G基因型较少，故将4G/5G和5G/5G合并为5G基因型、4G/4G基因型作为4G基因型进行分析。

1.3 统计学处理 使用SPSS 19.0统计软件。计量资料用表示，组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与PCOS发病的关系 PCOS组与健康对照组平均年龄为（24.10±5.51）、（26.10±5.21）岁，两组差异无统计学意义（P＞0.05）；两组患者BMI分别为（24.62±8.07）、（21.03±4.96）kg/m2，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。222例汉族妇女基因分析结果显示，PAI-1基因启动子区4G基因型频率为42.79%（95/222），5G基因型频率为57.21%（127/222）；其中PCOS组与健康对照组5G基因型频率分别为53.33%（64/120）和61.76%（63/102）；4G基因型频率分别为46.67%（56/120）和38.24%（39/102），两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 PAI-l基因启动子区4G/5G多态性与胰岛素抵抗的关系 胰岛素抵抗组与非胰岛素抵抗组PCOS患者腰臀比分别为0.83±0.45、0.79±0.12，两组差异无统计学意义（P＞0.05）；两组患者BMI分别为（25.14±4.76）、（23.26±1.97）kg/m2，两组差异有统计学意义（P＜0.05）；两组患者Homa-IR分别为2.71±0.81、1.98±0.54，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。胰岛素抵抗组与非胰岛素抵抗组5G基因型频率分别为48.98%（24/49）和56.34%（40/71）；4G基因型频率分别为51.02%（25/49）和43.66%（31/71），两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与肥胖的关系 肥胖组BMI、腰臀比和Homa-IR分别为（28.3± 3.0）kg/m2、0.87±0.14和2.6±1.3，均分别高于非肥胖组（22.1±1.2）kg/m2、0.81±0.06和2.1±0.9，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。肥胖组与非肥胖组5G基因型频率分别为59.26%（32/54）和48.48%（32/66）；4G基因型频率分别为40.74%（22/54）和51.52%（34/66），两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

PAI-1基因启动子区上游675碱基位点上存在鸟嘌呤插入或缺失，表现出4G/4G、4G/5G和5G/5G等3种基因型；而PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与血浆PAI-1水平升高、活性增高有关。4G等位基因附近只有转录激活物作用位点；5G等位基因附近不仅有转录激活物作用位点，还有转录抑制物作用位点；因此，4G等位基因转录活性高于5G等位基因。

PCOS患者血浆PAI-1活性明显增高，可能与PAI-1 4G等位基因密切相关，因此推测PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与PCOS发病有关。目前国内外相关研究存在争议：Sales等[9]对巴西地区PCOS患者与健康对照人群各79例进行PAI-1基因启动子区4G/5G多态性检测，PCOS组4G/4G基因型频率明显高于健康对照组，但两组间4G/5G、5G/5G基因型频率差异均无统计学意义，提示4G基因型可能与PCOS发病相关。Kilicci等[10]对土耳其地区PCOS患者与健康对照组各100例的相同基因位点进行基因型检测，两组间4G、5G等位基因和3种基因型频率差异均无统计学意义。国内研究发现PCOS患者PAI-1基因启动子区4G/4G基因型频率明显高于健康人群，5G/5G基因型频率低于健康人群，亦提示4G基因型可能与PCOS发病有关[11-12]。Lee等[13]报道在欧洲、土耳其及亚洲人群中，PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与PCOS易感性显著相关。Liu等[14]报道在亚洲人群中PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与PCOS发病具有明显相关性，但在高加索人群中差异无统计学意义；提示PAI-1基因启动子区4G/5G多态性分布存在种族和地域的差异。本研究对浙江地区汉族PCOS患者PAI-1基因型进行检测，发现PCOS组以4G基因型为主，健康对照组以5G基因型为主，提示4G基因型可能与浙江地区汉族PCOS发病有关；但本研究PCOS组与健康对照组间BMI差异有统计学意义，不能排除BMI对PAI-1基因启动子区4G/5G多态性分布的影响。

胰岛素可激活人肝癌细胞株HepG2细胞的信号转导系统，从而影响PAI-1的生物合成；这揭示了胰岛素诱导下丝裂原活化蛋白激酶的激活对PAI-1的调节作用。Lopez-Alemany等[15]首次在研究中提及PAI-1与胰岛素信号转导的关系，以及αvβ3整合素对胰岛素信号转导而起到调节作用；PAI-1与αvβ3整合素竞争，与玻璃体结合蛋白结合，在小鼠胚胎成纤维细胞中PAI-1阻止αvβ3整合素与胰岛素转导的协同作用，减弱胰岛素诱导的蛋白激酶B磷酸化作用，使得血管内皮生长因子表达和细胞迁移，进一步加重胰岛素抵抗。PAI-1基因启动子区4G/5G多态性通过升高血浆PAI-1水平及活性，从而影响胰岛素的敏感性，与胰岛素抵抗密切相关。胰岛素抵抗是PCOS重要的生理、病理机制，且PCOS患者存在纤溶系统失衡、血浆PAI-1水平升高等，间接提示PAI-1基因启动子区4G/5G多态性可能与PCOS患者胰岛素抵抗有关。本研究发现PCOS胰岛素抵抗组4G/4G基因型频率明显高于非胰岛素抵抗组，差异有统计学意义；这提示PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与PCOS患者胰岛素抵抗存在一定联系。Sales等[9]在探讨PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与PCOS的关系中指出，PCOS患者PAI-1水平为4G/4G基因型高于4G/5G、5G/5G基因型，且与胰岛素抵抗的发生有关，与本研究结果一致。

近年来研究表明，脂肪组织分泌的多种细胞因子可促进PAI-1合成，推测PAI-1与肥胖关系密切[16]。Ma等[17]一项动物研究发现，缺乏PAI-1的老鼠可完全防止肥胖的发生，提示PAI-1与肥胖可能存在直接的因果关系。Tarkun等[18]研究发现PCOS患者无论是否肥胖，PAI-1水平及活性均明显升高；瘦型PCOS患者PAI-1水平及活性升高不依赖于BMI，与胰岛素抵抗直接相关。赵君利等[19]研究表明PCOS肥胖患者的Homa-IR、BMI和腰臀比均高于非肥胖者，肥胖者的Homa-IR低于非肥胖者，这说明肥胖者胰岛素抵抗程度较非肥胖者严重，而非肥胖患者PAI-1基因启动子区4G基因型频率高于肥胖者。本研究发现PCOS肥胖患者BMI、Homa-IR均明显高于非肥胖者，表明PCOS肥胖患者胰岛素抵抗程度明显高于非肥胖者；非肥胖者4G/4G基因型频率明显高于肥胖组。以上结果与Tarkun等[18]、赵君利等[19]报道一致。因此，我们推测4G基因型可能是PCOS非肥胖患者血浆PAI-1水平及活性升高的重要因素，肥胖和胰岛素抵抗可能是影响PCOS肥胖患者PAI-1水平及活性的重要因素。此外，本研究发现PCOS患者4G/ 4G基因型频率为胰岛素抵抗组高于非胰岛素抵抗组、非肥胖组高于肥胖组，差异均有统计学意义，可能是本研究样本量偏小、PCOS患者非肥胖且胰岛素抵抗患者的比例偏高所致。因此，重视PCOS肥胖患者的体重控制外，应长期监测带有4G基因型的PCOS非肥胖患者的Homa-IR及PAI-1水平，并及时关注血糖、纤溶凝血系统等改变，这对预防糖尿病、心脑血管疾病等远期并发症具有重要意义。

综上所述，PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与浙江地区汉族PCOS的发病有关，而4G/4G基因型可能是PCOS发病的危险因素。4G/5G基因型分布与PCOS胰岛抵抗、肥胖等因素有关，其中4G/4G基因型可能是影响浙江地区汉族PCOS患者糖代谢异常发生、PCOS非肥胖患者病情发展的危险因素。因此，对不利基因型个体进行随访与深入研究，将有利于PCOS患者的防治。此外，我们认为测定血浆PAI-1水平对早期发现血栓前状态、早期预防和早期治疗，提高PCOS患者远期生存质量具有良好的指导作用。

[1] Li R,Zhang Q,Yang D,et al．Prevalence of polycystic ovary syndrome in women in China:a large community-based study[J]．Human Reproduction,2013,28(9):2562-2569．

[2] 华克勤,丰有吉．实用妇产科学[M]．北京:人民卫生出版社,2013:430-431．

[3] 王丽娜,李美芝．与卵巢疾病有关的综合征-多囊卵巢综合征的临床诊断和治疗[J]．中国实用妇科与产科杂志,2006,22(5):325-327．

[4] Orio F Jr,Palomba S,Cascella T,et al．Is plasminogen activator inhibitor-1 a card-iovascular risk factor in young women with polycysticovarysyndrome?[J]．RrprodBiomedOnline,2004,9:505-510．

[5] Furumoto,Tomoo,Fujii Satoslli,et al．Maladaptive arterial remodeling with systemic hypertension associated with increased concentrations in blood of plasminogen activator inhibitortype-l (PAI-1)[J]．TheAmericanJournalof Cardiology,2014(93):997-1001．

[6] Diamanti-Kandarakis E,Palioniko G,Alexandraki K,et al．The prevalence of 4G/5G polymorphism of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)gene in polycystic ovarian syndrome and its association with plasma PAI-1 levels[J]．Eur J EndocrInol,2004,15: 793-798．

[7] Glueck C J,Sieve L,Zhu B,et al．Plasminogen activator inhibitor activity,4G/5G polymorphism of the plasminogen activator inhibitor-l gene,and first-trimester miscarriage in women with polycystic ovary syndrome[J]．Metabolism,2006,55:345-352．

[8] Fr D D,Tarlatzis R．Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome [J]．Fertil Steril,2004,81(1):19-25．

[9] Sales M F,Sóter M O,Candido A L,et al．Correlation between plasminogen activeateor inhibitor-1 (PAI-1)promoter 4G/5G polymorphism and metabolic/proinflammatory factors in polycystic ovary syndrome[J]．Gynecological Endocrinology,2013,29(10): 936-939．

[10] Kilicci C,Bayram B,Ozkurt M,et al．Plasminogen Activator Inhibitor Type-1 Gene 4G/5G Polymorphism and Polycystic Ovary Syndrome[J]．Genetic Testing and Molecular Biomarkers,2013, 15(7-8):565-567．

[11] 庄朝辉,沈宗姬,黄亚珍,等．PAI-1基因4G/5G多态性与肥胖型多囊卵巢综合征的相关性研究[J]．中国医学创新,2013,10(21):1-3．

[12] 张朝晖,杨金兰,田玉栓,等．PAI-1基因多态性与多囊卵巢综合征的研究[J]．中国妇幼健康研究,2008,19(6):541-543．

[13] Lee Y H,Song G G．Plasminogen activator inhibitor-1 4G/5G and the MTHFR 677C/T polymorphis-ms and susceptibility to polycystic ovary syndrome:a meta-analysis[J]．Obstet Gynecol Reprod Biol,2014,175(4):8-14．

[14] Liu Y,Sun M G,Jiang R,et al．Plasminogen Activator Inhibitor-1-675 4G/5G Polymorphism and Polycystic Ovary Syndrome Risk:A Meta Analysis[J]．Assist Reprod Genet,2014,31 (3):363-370．

[15] Lopez-Alemany R,Redondo J M,Nagamine Y,et al．Plasminogen activator inhibitor type-1 inhibits insulin signaling by competing with alphavbeta3 integrin for vitronectin binding[J]．Eur J Biochem,2003,270(5):814-821．

[16] Michalska M,Iwan-Zie tek I,Gnilka W,et al．PAI-1 and a2-AP in Patients with Morbid Obesity[J]．Clin Exp Med,2013,22(6):801-807．

[17] Ma L J,Mao S L,Taylor K L,et al．Prevention of obesity and insulin resistance in mice lacking plasminogen activator inhibitor 1 [J]．Diabetes,2004,53(2):336-346．

[18] Tarkun I,Canturk Z,Arslan B C,et al．The plasminogen activator system in young and lean women with polycystic ovary syndrome[J]．Endocr J,2014,51(5):467-472．

[19] 赵君利,陈子江,赵跃然,等．纤溶酶原激活物抑制因子1基因启动子区4G和5G多态基因型分布及其多囊卵巢综合征的相关性研究[J]．中华妇产科杂志,2005,40:528-531．

Correlation of 4G/5G polymorphism of plasminogen activator inhibitor-1 gene promoter region with polycystic ovarian syndrome

LIU YuANWEI. DENG Miao. CEN Jiaping. et al. Department of Gynecology. Hangzhou Women's Hospital. Hangzhou 310008. China

Objective To investigate the correlation of 4G/5G polymorphism of plasminogen activator-1(PAI-1)gene promoter region with polycystic ovary syndrome(PCOS)in Zhejiang Han population．MethodsOne hundred and twenty patients with PCOS and 102 healthy women(control group)were enrolled from Zhejiang Han population．Body mass index(BMI)and waist-to-hip ratio(WHR)were determined．The 4G/5G polymorphism of the PAI-1 gene promoter region was amplified by the polymerase chain reaction(PCR)．Blood samples of PCOS patients were obtained,fasting insulin was detected by ELISA and fasting glucose was measured by glucose oxidase method,and insulin resistance index(Homa-IR)was calculated．Based on the BMI,PCOS patients were divided into obese(n=54)and non-obese(n=66)groups．Based on Homa-IR,the patients were divided into insulin resistant(IR,n=49)and non-IR(n=71)groups．ResultsThe rate of PAI-1 gene promoter region 4G/4G genotype was significantly higher in the PCOS patients than that in control group(P＜0．05)．The rate of 4G/4G genotype was significantly higher in the IR and non-obese groups than that in non-IR and obese groups(P＜0．05)．ConclusionThe genotype 4G/4G in PAI-1 gene promoter region may be associated with the pathogenesis of PCOS in Zhejiang Han population,which may be involved in the development of IR and PCOS,especially in non-obese patients．

Polycystic ovary syndrome Plasminogen activator inhibitor-1 Gene polymorphism Insulin resistance Obese

2015-04-20）

（本文编辑：陈丹）

浙江省科技计划项目（2009C33114）

310008 杭州市第一人民医院集团杭州市妇产科医院妇产科

张治芬，E-mail：zhangzf@zju.edu.cn