恶性黑素瘤组织iNOS的表达与血管增生研究

李 娟，冯亚兰，吴东辉，徐晓芃，旷 翎， 冯 浩

恶性黑素瘤组织iNOS的表达与血管增生研究

李 娟，冯亚兰，吴东辉，徐晓芃，旷 翎， 冯 浩

[摘要]目的 探讨恶性黑素瘤组织中iNOS表达与增生及临床资料相关性。方法 收集30例恶性黑素瘤患者皮损组织和20例色素痣患者的皮损组织，采用免疫组化检测恶性黑素瘤和色素痣组织中iNOS的表达，并与患者临床资料进行分析，同时观察其与癌细胞增生、血管生成的关系。结果 iNOS表达阳性率在恶性黑素瘤组织中比色素痣组织高(P＜0.05)，恶性黑素瘤iNOS表达在患者年龄、性别、部位中差异无统计学意义（P ＞0.05）。病理分期Ⅲ～Ⅳ期患者iNOS阳性率显著高于Ⅰ～Ⅱ期（P＜0.05）。iNOS阳性肿瘤患者细胞增生核抗原（PCNA）标志指数（PLI）和微血管密度（MVD）的值明显高于iNOS阴性肿瘤患者（P＜0.01）。结论 iNOS能促进恶性黑素瘤细胞增生与血管形成，是恶性黑素瘤的重要调节因子。

[关键词]黑素瘤，恶性；iNOS；细胞增生核抗原；血管生成

[中图分类号]R758.24

[文献标识码]A

[文章编号]1674-1293(2015)05-0329-03

DOI：10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20150504

基金项目：湖南省自然科学基金青年基金项目(09JJ4011)，湖南省人民医院仁术科研基金项目

作者简介：李娟，医学硕士，主治医师，研究方向：银屑病、黑素瘤，E-mail: juanlee0731@163.com

通讯作者：冯浩，E-mail: doctorfenghao@126.com

[Abstract]Objective To investigate the expression of iNOS in malignant melanoma(MM) and its correlation with the cancer cell proliferation, angiogenesis and clinical data, as well as its effects on the development of MM. Methods Total 30 cases of MM tissues and 20 cases of nevus were collected, and the immunohistochemical method was adopted to detect the expression of iNOS, then the clinical data were analyzed, finally the relationship between the cancer cell proliferation and angiogenesis was observed. Results The positive rate of iNOS in MM was higer than that of nevus group (P<0.05). In MM group, there was no relevance between the expression of iNOS and the gender, location and tumor growth pattern (P>0.05). The iNOS positive rate of pathological staging III-IV was significantly higher than that of I-II (P<0.05). The PLI and MVD value of iNOS positive tumors was obviously higher than that of iNOS negative tumors (P<0.01). Conclusion The expression of iNOS can promote the proliferation of cancer cells and vessel formation in MM, which is an important regulatory factor in tumor biological behavior.

收稿日期（2015-05-15 修回日期 2015-07-06）

作者单位：100084，北京市上地医院皮肤科（李娟）；湖南省郴州市第一人民医院（冯亚兰）；湖南省人民医院（吴东辉，徐晓芃，旷翎， 冯浩）

The relationship between the cancer cell proliferation, angiogenesis and the expression of iNOS in malignant melanoma

LI Juan，FENG Ya-lan，WU Dong-hui，et al
Department of Dermatology, Shangdi Hospital of Beijing, Beijing 100084, China

[Key words]Melanoma，malignant；iNOS；Proliferating cell nuclear antigen；Angiogenesis

[J Pract Dermatol, 2015, 8(5):329-331]

诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)可能与黑素瘤的进展相关。本研究主要探讨其在恶性黑素瘤组织中的表达及与癌细胞增生、血管生成的关系，以及与临床资料的相关性，现总结如下。

1　资料和方法

1.1 临床资料

收集2011年1月—2014年6月湖南省人民医院，长沙市中医医院与长沙市马王堆疗养院门诊及住院确诊为恶性黑素瘤的患者30例，其中男17例，女13例。平均年龄51岁 （29 ～82）岁，平均病程10个月（2个月～3年）。恶性黑素瘤TNM分期（AJCC 第7版），Ⅰ～Ⅱ期10例；Ⅲ～Ⅳ期20例。对照组20例为我院皮肤科与整形外科门诊就诊的色素痣患者，其中男11例，女9例。平均年龄46岁（18～62）岁。两组患者的年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05），

具有可比性。所有患者切除的皮损组织即刻置入4%甲醛液固定过夜，常规石蜡包埋，4 µm切片覆于多聚赖氨酸处理过的玻片上备用。

1.2 方法

iNOS抗体购自Labvision公司；免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术公司。采用Envision两步法进行免疫组化检测，阳性结果判定根据阳性细胞计数和阳性细胞染色强度判定。观察患者一般资料、肿瘤部位、生长方式、TNM分期与iNOS表达的相关性。

细胞增生核抗原（PCNA）阳性为绝大多数阳性细胞的胞核染色呈棕褐色颗粒状或弥散性，也有部分胞质着色。观察500个肿瘤细胞，PCNA 阳性细胞数所占的百分数即为PCNA标志指数（PLI）。微血管密度（MVD）标准按照Weidner法[1]计算肿瘤着色的毛细血管及微血管，在切片中随机选取20个高倍视野（HP），分别计算出这20个视野中的血管数，取其平均值，为该例患者的MVD。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0进行统计学处理，组间阳性率比较采用卡方检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1 恶性黑素瘤患者iNOS表达及与临床相关性

30例恶性黑素瘤患者中，iNOS阳性21例（70%），20例色素痣患者中iNOS阳性8例（40%），两组间差异具有统计学意义（χ2=4.433，P=0.035）。恶性黑素瘤iNOS表达在年龄、性别、部位中差异无统计学意义（P＞0.05）。而恶性黑素瘤患者病理分期Ⅲ～Ⅳ期者iNOS 阳性率显著高于Ⅰ～Ⅱ期，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表1，图1）。

表1　恶性黑素瘤患者iNOS表达与临床资料相关性[例(%)]

2.2 恶性黑素瘤患者iNOS表达与PLI 关系

iNOS阳性患者皮损PLI的值为（88.54 ±3.82）%，高于iNOS阴性者（77.13±4.01）%，两者比较差异具有统计学意义（t=7.395，P＜0.01）。

iNOS阳性患者皮损MVD值为（51.77 ±4.24）个/mm2，高于iNOS阴性者（41.81 ±5.20）个/mm2，两者比较差异具有统计学意义（t=5.514，P＜0.01）。

3　讨论

一氧化氮(NO)是一种多效且重要的生物调控递质，参与血管舒张、神经传递和细胞毒性等多种生物学过程[2]。NO由L-精氨酸产生，首次在内皮细胞和巨噬细胞中发现，在髓样细胞和其他细胞类型中，炎性细胞因子或细菌脂多糖刺激可引起NO合酶的同种型（iNOS）表达，产生大量的NO。但NO对肿瘤的影响存在两个不同方向，极高水平的NO对肿瘤细胞有细胞毒性作用，细胞内NO低水平可促进肿瘤进展和存活，以及诱导抗凋亡效果。iNOS可由炎症刺激因子等作用而产生出大量的NO，从而参与机体的病理生理过程，与许多肿瘤如肺癌[3]、胰腺癌等的进展及患者低存活率相关。

本研究发现iNOS在皮肤恶性黑素瘤中阳性表达率为70%，明显高于其在色素痣中的表达（P＜0.05）。有研究显示其在皮肤恶性黑素瘤中阳性表达率大约为47.7%[4]，这比本研究结果稍低，可能与地区、人种、样本数等差异有关。同时本研究还发现iNOS的表达在患者年龄、性别、肿瘤发病部位中均无差异（P

＞0.05），而与TNM分期有相关性（P＜0.05）。而TNM分期对指导患者的治疗及观察患者的预后有着十分重要的作用。

图1　恶性黑素瘤患者皮损组织病理（SP法）

iNOS 诱导产生高水平的NO，NO有助于血管生成和促进肿瘤进展。并且NO使血管内皮生长因子(VEGF)产生增多，而VEGF需要NO持续释放才能保证血管形成，并依靠NO环鸟苷酸途径促进肿瘤细胞VEGF释放的活力[5]。人体内肿瘤生长依赖于血管生成与再生，观察肿瘤内微血管生成状况及MVD有助于判断肿瘤患者的预后[7,8]。本研究显示，iNOS表达阳性患者皮损MVD高于iNOS表达阴性者（P ＜0.01)，表明iNOS 可能通过促进肿瘤血管生成在皮肤恶性黑素瘤中起到一定的作用。iNOS的表达亦被认为是肿瘤生物学行为中重要的调节因子[6]。

PCNA是一种与细胞增生有关的细胞周期蛋白，它参与细胞增生过程中的DNA复制。在细胞周期不同阶段表达结果也不同，尤其在细胞周期G1 期和S期表达最强。因此观察PCNA的表达情况能反映DNA合成与细胞增生情况。其对预测肿瘤的预后有着重要的作用。本研究显示iNOS阳性患者皮损PLI值明显高于iNOS阴性者（P＜0.01）。

综上所述，iNOS在恶性黑素瘤发生、增生、凋亡、转移和治疗中起着重要的作用，但仍需临床工作者不断深入探讨，从而为治疗恶性黑素瘤提供新的思路和方法。

【参 考 文 献】

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[3]Thomsen LL, Miles DW, Happerfield L, et al. Nitric oxide synthase activity in human breast cancer [J]. Br J Cancer, 1995, 72(1):41-44.

[4]Ekmekcioglu S, Ellerhorst JA, Prieto VG, et al. Tumor iNOS predicts poor survival for stage III melanoma patients [J]. Int J Cancer, 2006, 119(4):861-866..

[5]Joukov V, Pajusola K, Kaipainen A, et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases [J]. EMBO J, 1996, 15(2):290-298.

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（本文编辑 耿建丽）