六溴环十二烷的分析方法、生物累积特征及其选择性代谢研究进展

孙秀梅，张保琴，郝　青，钟　志，金衍健，郭远明

（1.浙江省海洋水产研究所，浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江舟山　316021；2.中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连　116023）

·综述·

六溴环十二烷的分析方法、生物累积特征及其选择性代谢研究进展

孙秀梅1，张保琴2，郝青1，钟志1，金衍健1，郭远明1

（1.浙江省海洋水产研究所，浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江舟山316021；2.中国科学院大连化学物理研究所，辽宁大连116023）

六溴环十二烷（hexabromocyclododecanes，HBCDs）属脂环族溴系添加型阻燃剂，是仅次于多溴联苯醚和四溴双酚A的世界第三大用量的阻燃剂产品。六溴环十二烷目前是斯德哥尔摩公约POPs候选化合物，其在水体、土壤、沉积物、鱼体、鸟类、哺乳动物和人体中均有检出，应对其所引起的生态环境风险和人体健康风险给予关注。本文对六溴环十二烷分析的主要色谱-质谱联用技术进行了介绍和评价，目前动物组织中六溴环十二烷残留检测方法有很多，其中高效液相色谱串联质谱法是主要方法。质谱法检测六溴环十二烷残留的前处理步骤为样品提取、净化和浓缩富集，通常经C18色谱柱或手性柱分离，由ESI负离子模式下质谱检测。本文同时也对六溴环十二烷的生物富集和选择性代谢降解进行了综述，并对生物体种六溴环十二烷的研究进行了展望。

六溴环十二烷；溴系阻燃剂；分析方法；生物累积；选择性代谢

六溴环十二烷（hexabromocyclododecanes，HBCDs）属脂环族溴系添加型阻燃剂，主要用于阻燃聚苯乙烯泡沫材料、纺织品、环氧树脂、硅树脂、涂料、黏结剂等，是仅次于多溴联苯醚和四溴双酚A的世界第三大用量的阻燃剂产品。随着多溴联苯醚（PBDEs）在欧洲和北美等一些国家的禁止使用，HBCDs作为PBDEs的取代品，其需求量和使用量日益增加。HBCDs作为一种添加型的溴代阻燃剂，由于缺乏化学键作用，在产品的生产、使用、回收和最终处理过程中容易从产品中释放出来，造成环境污染，在水体、土壤、沉积物、鱼体、鸟类、哺乳动物和人体中均有检出［1-3］。HBCDs理论上可能存在16种立体异构体，商品级HBCDs主要有3对对映结构的异构体，分别是（±）α-HBCD（10%～13%）、（±）β-HBCD（1%～12%）、（±）γ-HBCD （75%～89%）。市售的HBCDs还发现了两种含量较少的δ-HBCD、ε-HBCD，浓度分别为0.5%和0.3%。其作为高持久性、高生物蓄积性和毒性物质，已发现广泛存在于环境和人体中［4］。六溴环十二烷已被列入了OSPAR优先控制化学品名录。2013年5月六溴环十二烷被列入《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》禁用化学制品黑名单，但在2019年前，六溴环十二烷仍可用在建筑用聚苯乙烯领域。HBCDs可对生态环境及动物造成伤害，如对动物的大脑、肝脏、肾脏等器官以及内分泌、生殖发育系统和神经系统都有毒性［5-7］，因而受到各研究领域的广泛关注。

1　分析方法

1.1样品前处理

分析测试技术的快速发展为生物样品中污染物的分析提供了有效的技术手段。样品中HBCDs的提取方法与其它含卤素疏水性有机化合物的提取方法类似，并无特殊要求，主要包括索氏提取、加速溶剂萃取和振荡提取等［8-16］。生物样品经提取后，提取液中除了HBCDs，通常还包括其它有机卤素化合物，如有机氯农药，多氯联苯、多溴联苯等和其它杂质。这些干扰物质在质谱检测时会产生严重的基质干扰，抑制目标分析物的信号强度。电喷雾（ESI）模式质谱检测与大气压化学电离（APCI）、大气压光电离模式（APPI）的质谱检测相比，更容易受到基质效应的干扰。为减少干扰物质对HBCDs分析检测的影响，需要在样品提取之后进行合适的净化处理，将干扰物质与HBCDs分离。常用的净化方法有浓硫酸酸化、凝胶渗透色谱法（GPC）和柱层析法。

生物样品中的脂肪会对样品中HBCDs的分析造成干扰，可以采用浓硫酸或GPC进行除脂净化。破坏性的酸化处理是一种有效而简单的除脂方法，使用时要注意目标分析物的稳定性。用于HBCDs净化的浓硫酸酸化时间一般不要太长，酸化时间过长到导致样品中HBCDs的损失。ZACS等［8］采用混合溶剂二氯甲烷/正己烷（1：1）振荡提取样品，提取液加硫酸振荡酸化15 min，后又静置15 min分离有机相进行进一步的净化浓缩。浓硫酸可以去除大分子化合如脂类，但许多极性化合物等干扰物仍然共存于提取液，基质干扰物会粘附在离子源表面，导致热不稳定的HBCDs分解，降低方法的灵敏度，因此有必要采取进一步的分离净化。GPC净化是一种非破坏性的净化方法，基于物质分子量的大小进行分离除杂。分离常用于HBCDs净化的GPC柱填料主要为中性、多孔的聚苯乙烯二乙烯基苯共聚物，洗脱溶剂包括环己烷/乙酸乙酯溶剂。GPC净化对大分子基质物的分离效率不超过95%。样品只采用单一净化方法如浓硫酸酸化或GPC净化，在高分辨质谱技术-飞行时间质谱分析时都会存在严重的基质干扰效应，与标准溶液检测比，信噪比降低90%［9］。

HBCDs提取后，样品的净化主要通过柱层析来实现，所用的纯化材料包括弗罗里硅土、硅胶和氧化铝。ZACS等［8］采用弗罗里硅土柱纯化三文鱼样品中的HBCDs，正己烷洗脱的组分丢弃，正己烷二氯甲烷混合溶剂洗脱的组分收集浓缩待分析。采用中等极性溶剂洗脱，达到HBCDs与其它有机溴化合物的分离，如PBEDs。我们的研究发现，多步净化处理可以有效去除干扰物，HBCDs的回收率可达80%以上。

1.2色谱分离

生物样中HBCDs的分析检测属于复杂基质中痕量组分的分析检测技术。最早用于分析HBCDs的方法是气相色谱法（GC）和气相色谱质谱法（GC-MS），但这一分析技术受化合物性质局限，由于HBCD热稳定性差，在160℃以上会发生热重排，导致异构体相互转化。因此GC法和GC-MS法不适合测定异构体，只用于HBCDs总量的测定［10］。此外，200℃时HBCDs会发生脱溴分解导致测试结果的不确定［11-12］。近年来，随着高效液相色谱-质谱（LC-MS）或高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）技术的快速发展，LC-MS已成为生物样中HBCDs测定普遍采用的方法，尤其适合HBCDs异构体分析。因α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD结构的差异导致各异构体的环境稳定性、生物富集和代谢转化均不同，对HBCDs异构体准确的定性定量分析是研究HBCDs的关键。

对于HBCDs立体异构体的分离分析，所采用的流动相一般为甲醇、乙腈和水三相，此三相按照一定的比例梯度洗脱，甲醇含量和温度是影响α-HBCD、β-HBCD分离的重要因素，流动性中乙腈影响γ-HBCD分离效果［8］。所采用的色谱柱通常为反相C18填料的色谱柱，如Waters Atlantis T3，XDB-C18，Kinetex C18，柱长通常为15cm或10cm，粒径一般为3 μm或3.5 μm［13-15，17］。在HPLC基础上发展起来的超高效液相色谱（UPLC）技术提供了更大的色谱峰容量、更高的分辨率和灵敏度以及更快的分析速度。UPLC技术采用了1.7 μm细颗粒固定相，流动相在最高可达103 MPa（15 000 psi）的高压下运行。越来越多地应用于HBCDs异构体分析［8，18］。由于HBCD的3种异构体的物理性质和化学性质均很相似，很难在短时间内同时分离，使用UPLC更有利于缩短分析时间、提高色谱分辨率和分析通量。随着对生物体差异性富集HBCDs异构体认识的深入，普通的C18填料色谱柱不能满足HBCDs对映异构体分析的需要。利用手性色谱柱可以实现对不同对映异构体的分离和检测。除利用手性色谱柱，ESSLINGER et al［19-20］，KÖPPEN et al［21］，和GAO et al［22］利用串联色谱柱来改善HBCDs对映异构体的分离，第一根为C18色谱柱，第二根为环糊精手性柱。α-HBCD的分辨率达到1.1，γ-HBCD的分辨率更高。单柱分析时，手性柱的柱容量达到55%～70%，受共流出物干扰较大。为改善柱容量和单柱分析时的基线分离，BESTER等［23］用二维液相色谱来分析HBCDs对映异构体，α-HBCD的分辨率达到4.11，手性柱柱容量仅利用6%。

1.3质谱检测

由于质谱检测的高选择性和高灵敏度，质谱检测技术已成为持久性有机污染物分析中的首选。HBCDs的质谱检测均是在ESI负离子模式下实现的。HBCDs的最常用检测手段是低分辨三重四级杆或四极线性离子阱串联质谱技术，其成本低、用途广泛。串联四级杆质谱检测HBCDs时，多反应监测模式（SRM）下准分子离子［M-H］-（m/z638.6和640.6）脱溴产生［Br］-（m/z78.9和80.9），同位素内标的准分子离子［M-H］-（m/ z652.6）脱溴产生［Br］-（m/z78.9和80.9）［15，17］。在ESI源的负离子模式下，准分子离子［M-H］-，和与氯加和形成的［M-H+Cl］-都是其在电喷雾质谱中的特征离子。在实际的样品检测过程中发现［M-H+Cl］-的响应不如［MH］-稳定［18］。近年来高分辨质谱技术-飞行时间质谱和轨道阱质谱在HBCDs检测中的应用研究越来越多。高分辨质谱具有质量分辨率高和精确分子量的功能，可以得到化合物的元素组成和痕量成分在复杂背景中的确证和筛选，但应用于HBCDs分析的还较少。轨道阱质谱技术兴起于2000年，现在已发展成为一种主流的检测技术。ZACS et al［8］建立了超高效液相色谱-高分辨轨道阱质谱（Orbitrap-HRMS）分析HBCDs的方法，方法的定量限可达0.005～0.012 ng/g鲜重，SIM模式下监测其准分子离子［M-H］-（m/z638.6396和640.6374），在MS2模式下监测m/z 640.64→80.9150离子对。高分辨轨道阱质谱检测HBCDs，其SIM模式的检出限至少比MS2模式的低一个数量级。飞行时间高分辨质谱（UHPLC-TOF-HRMS）分辨率高、扫描速度快、扫描质量范围宽，在全扫模式下即可实现化合物准确分析。UHPLC-TOF-HRMS的检测分析更易受样品基质效应的干扰。UHPLC-TOF-HRMS分析中ESI-模式下的离子碎片丰度最大的为［M-H］-（m/z 640.6514），同时［M+Cl］-（m/z 676.6290）的离子碎片丰度也较高，影响HBCDs分析的准确度［24-25］。流动相中添加乙酸铵可以抑制此碎片离子，但是此方法并不能完全消除［M+Cl］-的干扰，还会产生乙酸与HBCD分子加合物［26-28］。在ZACS等［9］建立的UHPLC-TOF-HRMS分析方法中，［M+Cl］-离子碎片丰度并未超过基峰［M-H］-的15%，也并未影响HBCDs分析的准确度和精密度。［M-H］-碎片离子丰度受离子腔温度、雾化气压和碰撞电压等因素的影响。雾化气压高于40 psig时，HBCDs检测灵敏度下降。ZACS et al［9］利用UHPLCTOF-HRMS分析鳗鱼中的HBCDs，仪器的定量量（i-LOQ）达到0.9～4.5 pg，相应方法的定量限（m-LOQ）达到7.0～29 pg/g鲜重。

2　生物累积效应

HBCDs在环境中难降解，可以长期存在，并随环境介质进行长距离迁移［4，29］。研究者们对其环境行为及其在环境中的累积水平进行了细致的研究。HBCDs在生物体、土壤、沉积物和空气等环境基质中均有检出，包括人体母乳和北极［30-38］。并且随年代增加，环境中的HBCDs累积有增加的趋势。东格陵兰岛环纹海豹样品中HBCDs平均含量在1986-2008年间由2.0 ng/g增加到8.7 ng/g（脂质含量）。由于立体异构体空间结构上的差异性，导致其物理化学性质（如极性、偶极矩、水溶性）有一定程度的区别，这导致立体异构体的环境行为存在显著差别。HBCDs工业品在环境中存在立体异构体选择性的环境转化、生物累积和代谢行为。研究表明，环境样品（沉积物、土壤、淤泥、污水等样品）中HBCDs的主要成分是γ-HBCD，占总HBCDs的60%以上［31］；在空气中的HBCDs主要为α-HBCD和γ-HBCD，β-HBCD含量很少［34-36］；而在生物样品中α-HBCD占HBCDs总量的80%以上，并且α-HBCD化合物在水生无脊椎动物、海水鱼类、淡水鱼类、鸟类和海洋哺乳类动物中的含量依次增加，而γ-HBCD化合物的含量依次降低［4，30］。尽管大多数生物样品中HBCDs都以α-HBCD为主，但生物中HBCDs的组成仍然显示出物种、采样区域和营养级的差异性［39-44］。通过近年来对环境中HBCDs的环境行为、环境归宿等调查研究，环境样品中存在HBCDs的立体异构体选择性富集特征得到国内外学者的普遍认可［45］。然而，详细深入的选择性富集原因的研究仍然是缺乏的。对环境样品特别生物样品中HBCDs的立体异构体选择性富集是多因素共同作用的结果。包括暴露来源、异构体间水溶性、生物可利用性、生物体不同组织器官选择性的吸收与排泄、不同的生物代谢速率及生物体内的立体异构体选择性转化等行为。可见对HBCDs的生态危害性评价需要综合考虑上述因素，对3种立体异构体分别进行精确定性定量分析。

有关HBCDs毒代动力学的研究十分有限。仅有几个研究，以鱼和大鼠为供试动物揭示了HBCDs在动物体内的同化效率、生物放大系数、半衰期、累积和清除动力学以及生物累积性与异构体化合物对映体分数的关系［46-49］。LAW et al［47］的研究发现虹鳟中γ-HBCD化合物的同化效率最高（46%），β-HBCD化合物（41%）次之，γ-HBCD化合物的同化效率最低（31%）。DU et al［46］利用斑马鱼作为模式生物的实验发现的实验结果表明α-HBCD异构体的同化效率最高，β-HBCD异构体次之，γ-HBCD异构体同化效率最低，而净化速率则正相反。这和虹鳟鱼的实验结果存在显著不同。DU et al［46］的结果还发现HBCD 3种异构体的同化效率与净化速度还与浓度有关。与HAUKAS［48］利用HBCD工业品混合物喂养虹鳟鱼实验结果也存在明显差别。在这一研究领域，研究结果还存在相互矛盾的地方有待进一步研究。关于HBCDs的毒性实验多是针对HBCDs混合物，关于特定异构体的毒性数据较少，更是缺乏组织特异性的研究。最近在多溴联苯醚的研究中发现脂肪并不是影响BDE209分布的主要因素，BDE209在中华鲟肝脏、腮、肠、性腺等器官中的含量均比脂肪中含量高。各组织器官间的分配模式是影响多溴联苯醚生物累积性的重要因素［50］。目前HBCDs这方面的研究还没有，缺乏HBCDs异构体在鱼体不同组织、器官和不同性别中毒代动力学的基础数据。

3　选择性代谢

HBCDs生物降解产物的数据对于其环境影响评价是重要的，然而在例行的污染物环境风险调查中，并没有其代谢产物环境行为、归趋以及人体健康风险的评价指标。目前关于HBCDs生物降解产物的研究很少，更是缺乏其在亲代与子代间的选择性遗传代谢行为的研究。仅在大鼠、小鼠中HBCDs生物代谢降解产物的研究中表明［51-52］，HBCDs可激活Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶系统，特别是细胞色素P450酶系（CYP2B和CYP3A），这些与污染物降解有关的酶系会使HBCDs脱溴或羟基化，并因此产生累加的或放大的毒性效应［53］。HELDUR等利用老鼠单剂量暴露α-HBCD或γ-HBCD的体内代谢实验结果表明α-HBCD和γ-HBCD的代谢途径明显不一致，并且γ-HBCD的代谢程度远大于α-HBCD。α-HBCD代谢为单羟基六溴代谢物，可以进一步降解与谷胱甘肽结合由尿液排出。γ-HBCD可以进行开环和氧化反应转化为二羧酸代谢物（六溴十二烷二酸），并进一步脱羧基化和β氧化，形成奇碳原子数羧酸（三溴壬烯酸），最终经尿液排出。在排泄物和其它组织未发现γ-HBCD的六溴代谢物，而全部是脱溴和氧化代谢物（单羟基五溴环十二烯、二羟基五溴环十二烯和二羟基二羟基五溴环十二烷二烯）。HBCDs体外代谢实验研究也表明各异构体的代谢降解是不同的。ZEGERS et al［44］利用老鼠肝脏微粒体体外孵化实验证实β-HBCD和γ-HBCD可以代谢为单羟基化代谢产物，未发现α-HBCD的代谢产物，在海豹肝微粒体的体外孵化实验中也证实了这一结论。ESSLINGERE et al［46］利用老鼠肝微粒体体外孵化实验结果表明各对映异构体代谢能力不同，（-）-α-HBCD和（+）-γ-HBCD相对于它们的对映异构体而言，更容易富集而不被转化和降解，并且每种异构体都有单羟基化和双羟基化代谢方式。在大鼠慢性剂量的商品级HBCDs暴露中，氧化还原脱溴是它的一种代谢方式，没有确定每种异构体是否都存在这种代谢途径［47］。XIAOBO et al［54］利用鸡肝微粒体研究HBCDs的体外代谢，结果表明羟基化代谢物是HBCDs的主要代谢产物，在鸡肝微粒体的孵化实验中没有HBCDs非对映异构体和对映异构体之间的转化，或许在鸡中HBCDs各异构体之间的转化并不是细胞色素P450酶系介导的。不同物种对HBCDs选择性富集模式不一致，不同物种间污染物的转化降解速率也是不同的，不同物种间HBCDs的分布特征和代谢降解产物的轮廓并不相同［55］。对生物体内HBCDs异构体组织器官特异性分布特征和代谢产物分布模式的明确有助于评价其污染源。因此非常有必要进行种属专一性的HBCDs代谢降解试验研究，阐明其降解机制、速率、途径、产物以及遗传代谢行为规律。

4　总结与展望

综上所述，色谱-质谱联用技术是HBCDs定性定量分析的核心技术。由于HBCDs的热不稳定性，随着高效液相色谱-质谱（LC-MS）或高效液相色谱-串联质谱（LC-MS-MS）技术的快速发展，LC-MS已成为样品中HBCDs测定普遍采用的方法。HBCDS的最常用检测手段是低分辨三重四级杆或四极线性离子阱串联质谱技术。HBCDs的分析方法正在从低分辨色谱-质谱联用法向高分辨色谱-质谱联用法发展，超高效液相色谱-飞行时间质谱（UHPLC-TOF-HRMS）和超高效液相色谱-轨道阱质谱（UHPLC-Orbitrap-HRMS）技术已越来越多地应用于HBCDs分析。高分辨质谱对样品的净化除杂要求比较高，否则目标物碎片离子检定时会产生严重的基质干扰效应。在色谱分析中，通常所采用的色谱柱为反相C18填料的色谱柱。随着对生物差异性富集HBCDs非对映异构体和对映异构体认识的深入，手性色谱柱或二维色谱也应用于HBCDs的分析。然而，详细深入的选择性富集原因的研究仍然是缺乏的。对环境样品特别生物样品中HBCDs的立体异构体选择性富集是多因素共同作用的结果，包括暴露来源、异构体间水溶性、生物可利用性、生物体不同组织器官选择性的吸收与排泄、不同的生物代谢速率及生物体内的立体异构体选择性转化代谢等行为。

但由于分析方法及暴露源的不同，以及缺乏不同实验室间的数据比对分析，对不同区域、不同物种间HBCDs选择性富集特征进行比对仍缺乏可行性，关于HBCDs环境行为和生物累积效应的研究仍有待加强。目前HBCDs生物降解产物的研究很少，HBCDs各异构体的代谢降解途径并不相同。因研究模式和基体的不同，研究者得到的结论并不一致。此外由于质谱数据库和代谢物标准品的缺乏，也是HBCDs生物代谢研究的瓶颈。有关HBCDs累积和代谢机制的研究仍比较粗浅，对其选择性累积和代谢机制的研究仍需要加强。

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Research Advances in Analytical Methods，Bioaccumulation and Species-specific Metabolism of Hexabromocyclododecanes

SUN Xiu-mei1，ZHANG Bao-qin2，HAO Qing1，et al
（1. Marine Fisheries Institute of Zhejiang Province， Maine and Fishery Institute of Zhejiang Ocean University， Zhoushan 316021； 2. Dalian Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences， Dalian 116023， China）

Hexabromocyclododecanes（HBCDs）are cycloaliphatic brominated flame retardants.As the third most used brominated flame retardants in the world，after tetrabromobisphenol A and polybrominated diphenyl ethers，HBCDs are Stockholm Convention POPs candidate compounds，and have been found widely distributed in air，sediment，fishes，birds and human blood and milk.So the ecological risk and human health risk induced by HBCDs should be concerned.Mass spectrome techniques coupled to liquid chromatography are used most frequentlly in the detection and quantification of hexabromocyclododecanes.In this paper，the analytical methods of HBCDs，including sample extraction，clean-up，concentration，chromatography separation and mass spectrometry analysis，were critically reviewed.LC separation of HBCDs was carried out using C18 reversedphase analytical column or chiral column.The negative ion mode was usually used for the acquisition of massspectra.Meanwhile，the bioaccumulation and species-specific metabolism of HBCDs were summarized.The future reseach trends of hexabromocyclododecanes in this field are also discussed.

hexabromocyclododecanes；brominated flame retardants；analytical methods；bioaccumulation；species-specific metabolism

X13

A

1008-830X（2016）02-0165-07

2016-01-20

国家自然科学基金（21407127）；浙江省科技厅公共服务项目（2016F30021）

孙秀梅（1982-），女，山东临沂人，高级工程师，博士，研究方向：环境中典型污染物对水产品质量安全的影响.E-mail：xmsun@dicp.ac.cn