急性胰腺炎与自噬

李红昌 徐可 陈亚峰 奉典旭



急性胰腺炎与自噬

李红昌 徐可 陈亚峰 奉典旭

急性胰腺炎(AP)是长期困扰人类的一类复杂的疾病，随着生活水平的提高，发病率有逐年增高的趋势，其中10%～20%的AP可发展为重症急性胰腺炎(SAP)。SAP临床上起病急、变化快、并发症多，死亡率高达20%[1-2]，一直是临床上治疗的难点和挑战。目前对SAP的治疗仍缺乏特异、有效的措施，究其原因主要是尚不明确其确切的发病机制。大多数研究认为AP的病理基础系酶原在胰腺细胞内非正常的激活，从而引起胰腺的自我消化，进一步引起局部及全身炎症反应[3-4]。一些研究认为细胞内的酶原提前激活和异常的钙离子信号通道、细胞外低pH、溶酶体和酶原聚集等众多因素有关。自噬及溶酶体组织蛋白酶的改变则是近年新的研究热点[5]。本文就自噬，尤其是异常自噬在AP中的研究及进展综述如下。

一、自噬概况

自噬又名Ⅱ型程序性细胞死亡，广泛存在于真核生物的病理生理过程中，首先由Ashford和Porter[6]于1962年用电子显微镜在人的肝细胞中观察到。自噬是胞质内蛋白质和细胞器在膜包囊泡形成的自噬体中降解成氨基酸、核酸小分子的生物学过程，在细胞营养缺乏时，可维持蛋白质代谢平衡及细胞环境稳定，在生长发育中扮演重要角色。自噬可分为小自噬(microautophagy)、分子伴侣介导自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)和大自噬(macroautophagy)3种形式[7-8]。一般所说的自噬即大自噬，其过程可分为以下3个步骤[9-11]：(1)自噬诱导因子刺激细胞后在胞质某个位置形成吞噬泡(phagophore)；(2)吞噬泡不断延伸，胞质中细胞器等成分被揽入吞噬泡，成为密闭的球状自噬体(autophagosome)；(3)自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autolysosome)。自噬在维持内环境稳定、清除废物及结构重建中起重要作用，它一方面通过降解自身的物质，清除对细胞生长有害的物质，促进细胞生存；另一方面，当细胞受到过多损伤打击时，自噬被异常激活或自噬通路受阻导致自噬泡异常积累，引起细胞死亡，进而导致多种疾病的发生[12-13]。

二、自噬与AP

AP的早期特征是胰腺腺泡细胞胞质出现空泡，空泡内蛋白酶原被激活。关于空泡来源、形成的机制以及在酶原激活中的作用还不完全清楚。1980年Helin等[14]观察了6例SAP患者胰腺腺泡的超微结构，在水肿性炎症的胰腺实质腺泡细胞内发现酶原颗粒的改变和腺泡空泡的增加，表明自噬现象增加。随后，Watanabe等[15]在雨蛙素诱导的AP动物模型中描述了有关腺泡细胞胞质空泡化的形态学特征，即腺泡细胞中出现的空泡是双层膜，且膜上有自噬标志物轻链蛋白3Ⅱ(light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ)的存在，因此考虑这些空泡是自噬来源的[16]。而且在这些空泡内发现未完全消化的细胞内容物及胰蛋白酶，更进一步证实胰蛋白酶原的激活可能与自噬有关[17]。Sherwood等[18]的研究显示，AP早期胰蛋白酶原的激活发生在胰腺腺泡细胞大空泡内，提示自噬也许与AP的发生及发展有某种联系。Hayashi-Nishino等[19]研究发现在自噬相关基因5(autophagy associated gene 5，ATG5)敲除的小鼠中，胰蛋白酶原的激活和空泡的积累显著减少。腺泡细胞胞质的空泡与酶原激活有关，其机制可能是自噬在酸性环境下把胰蛋白酶原运送至溶酶体从而造成酶原激活[20]。因此认为，胞质细胞空泡是自噬的起源，自噬程度与空泡数量和AP 的严重程度呈一定的比例关系，自噬现象、酶原颗粒的改变和酶原激活与胞质内空泡形成有关。自噬为胰蛋白酶原的激活搭建了桥梁，在AP胰蛋白酶原的异常激活中起着重要作用。Mizushima等[21]发现小鼠禁食24 h后，胰腺外分泌组织中GFP-LC3融合蛋白量升高，生理性自噬增强。这可能是由于胰腺外分泌组织中蛋白质合成速度快，需要大量消除有缺陷或过量的蛋白质，造成自噬高效，说明生理性自噬对胰腺外分泌组织可能发挥保护作用。

三、异常自噬与AP

高效的自噬在胰腺炎发生中非常重要，增强的自噬不仅可以调节胰腺炎的应激反应，而且在受损伤的腺泡细胞内，受损的细胞器可以通过自噬过程被移除；当自噬功能受损时，不能移除这些细胞器，最终导致或加重胰腺炎的发生。Gukovsky和Gukovskaya[17]通过对分离的胰腺细胞、动物模型和人体组织的研究，发现AP时自噬量受损，胰腺腺泡内大量异常自噬空泡堆积，受损的自噬参与腺泡细胞的空泡和酶原的激活，从而引起AP的发生。研究发现[22-23]，与饥饿诱导的自噬相比，胰腺炎时腺泡细胞中含有更多更大的空泡，同时伴随LC3-Ⅱ水平的增加。胰腺炎时长效蛋白的降解率明显降低和特异的自噬降解蛋白p62 水平增加，也证明了胰腺炎时自噬受到损伤。越来越多的证据表明，异常自噬导致胰蛋白酶原在胰腺腺泡细胞内激活并损伤胰腺腺泡细胞而启动AP[20,24]。AP中产生异常自噬的原因可能有3个[23]：(1)自噬早期某些原因致其过度激活，产生大量自噬体不能被及时顺利清除而导致其异常积累。(2)自噬晚期因溶酶体功能障碍导致自噬体与溶酶体融合障碍，自噬体不能被及时清除而异常积累。(3)自噬晚期自噬体与溶酶体融合后形成自噬溶酶体，但溶酶体中各类水解酶活性下降致自噬溶酶体内待降解物质不能被清除，自噬溶酶体异常积累。

1．AP时自噬过度激活：自噬标志物Beclin1是酵母ATG6的同系物，也是第一个被确认的哺乳动物自噬基因，对自噬体的形成至关重要。Beclin1与磷脂酰肌醇-3-激酶Ⅲ类(class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase, PI3KC3)结合形成复合物促进自噬的形成。研究表明[25-26]，在雨蛙素诱导的AP中，胰腺组织Beclin1表达增加且与自噬空泡变化一致，提示自噬被激活且参与腺泡细胞的自噬空泡的形成。Hashimoto等[25]通过对ATG5 敲除的小鼠注射雨蛙素建立AP动物模型，发现ATG5 基因敲除后小鼠胰腺腺泡细胞中自噬减少，胰蛋白酶原的活性明显降低、AP的严重程度减轻。Feng等[27]发现，用IL-22重组腺病毒注入野生型鼠体内或使用IL-22的转基因鼠可以明显减轻雨蛙素所致的AP，且腺病毒注入后Bcl-2家族蛋白水平明显升高，其机制可能是IL-22诱导Bcl-2家族蛋白过表达，后者通过与Beclin1结合，阻断自噬体的形成，从而减轻了AP的严重程度。Yang等[28]通过阻断NF-κB通路，减轻了AP的严重程度，并发现自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ及自噬泡的形成减少，推测也是由于自噬受抑而使AP的严重程度减轻。

2．AP时自噬体与溶酶体融合障碍：溶酶体的完整性和降解能力主要取决于溶酶体相关膜蛋白(lysosomal-associated membrane protein，LAMP)，LAMP是高度糖基化的跨膜蛋白，对溶酶体的功能发挥重要意义[29-30]。自噬过程中自噬体和溶酶体的融合步骤主要依赖于LAMP-2的介导，如果自噬体不能将包绕的物质运送到溶酶体并与之融合，将产生严重后果。如Danon心肌病是一种LAMP-2缺陷性疾病，因自噬体不能与溶酶体融合，应激状态下可导致ATP 耗竭和细胞坏死性死亡[31]。Mareninova等[32]在敲除LAMP-2基因的小鼠胰腺中发现堆积的自噬泡和受损伤的腺泡细胞，表明LAMP-2基因敲除会引起胰腺中自噬的损伤。Boonen等[33]报道，在缺乏LAMP-2 的小鼠中溶酶体/自噬功能受损，引起以腺泡细胞空泡增多、继而发展为浸润性炎症导致腺泡细胞坏死为特征的自发性胰腺炎以及胰腺组织结构的破坏。Fortunato等[34-35]发现，AP小鼠胰腺腺泡细胞中出现大量自噬体，但是自噬溶酶体并没有明显上升，且伴随溶酶体相关膜蛋白LAMP-2的缺失，推测LAMP-2缺失导致自噬体和溶酶体融合障碍，自噬途径被阻断，使受损细胞器降解减少，即细胞可循环利用的小分子物质减少，从而使细胞向坏死方向发展，加重AP。

3．AP时溶酶体水解酶活性下降：各种原因致自噬通路受阻，其中最重要的是溶酶体内各种水解酶活性受影响，尤其是组织蛋白酶激活减少。研究发现[22]，AP时溶酶体中成熟的组织蛋白水解酶减少，大量非成熟的组织蛋白水解酶聚集。Gukovsky和Gukovskaya[16]研究发现，胰腺炎时组织蛋白酶的加工受到损伤，导致成熟的组织蛋白酶数量减少并伴有中间产物的堆积。研究证实[36-37]，AP时组织蛋白水解酶B(cathepsin B, CatB)和组织蛋白水解酶L(cathepsin L, CatL)在胰蛋白酶原异常激活过程中起着截然不同的作用。CatB可以催化胰蛋白酶原向胰蛋白酶转换，而CatL降解胰蛋白酶原和胰蛋白酶。当自噬损伤时，CatL活性相对CatB活性下降更明显，两者比例失调，导致CatL不足以降解被CatB激活的胰蛋白酶，使自噬溶酶体中活性胰蛋白酶增多，胰蛋白酶在自噬泡中积累，从而引起AP。Dennemärker等[38]研究也证实，当敲除小鼠的CatL基因后，自噬对胰酶原降解降低。Gukovsky和Gukovskaya[17]发现，AP发生时在大量空泡聚集的同时，成熟的CatB和CatL减少，活性下降，而用药物抑制CatB和(或)CatL活性均可导致腺泡细胞空泡化，这是由于AP时CatB和CatL分解功能下降，导致溶酶体降解功能下降，从而使自噬受损、空泡聚集。所以，溶酶体降解功能障碍可能是胰蛋白酶激活的重要作用机制之一。

总之，自噬与AP的发生、发展密切相关。受损的自噬不仅可以导致AP发病早期胰酶异常激活，而且还可介导炎症的病理生理过程[39-40]，细胞自噬的缺陷或自噬相关蛋白的变异与炎症反应密切联系，自噬受损和炎症相互作用参与AP的病理生理过程。进一步研究自噬作用、自噬识别环节受损以及自噬、炎症和细胞死亡的相互关系从而明确自噬在AP中的作用，不仅具有重要的学术价值,而且有助于寻找AP,尤其是SAP治疗的新靶点和防治策略。

[1] Tomas Ratia Gimenez, Alberto Gutierrez Calvo, Javier Granell Vicent. Etiology of acute pancreatitis [J]. Central European Journal of Medicine, 2014, 9(4): 530-542.

[2] Lankisch PG, Apte M, Banks PA. Acute pancreatitis [J]. Lancet, 2015, 386(9988): 85-96.

[3] Vidarsdottir H, Möller PH, Vidarsdottir H, et al. Acute pancreatitis: a prospective study on incidence, etiology, and outcome [J]. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2013, 25(9): 1068-1075.

[4] Van Acker GJ, Perides G, Steer ML. Co-localization hypothesis: a mechanism for the intrapancreatic activation of digestive enzymes during the early phases of acute pancreatitis [J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(13): 1985-1990.

[5] Sah RP, Saluja A．Molecular mechanisms of pancreatic injury [J]．Curr Opin Gastroenterol，2011，27(5): 444-451.

[6] Ashford TP，Porter KR. Cytoplasmic components in hepatic cell lysosomes[J]. J Cell Biol, 1962, 12(1):198-202.

[7] Mehrpour M, Esclatine A, Beau I, et al. Autophagy in health anddisease: Regulation and significance of autophagy: an overview[J].Am J Physiol Cell Physiol, 2010, 298(4): 776-785.

[8] Orenstein SJ,Cuervo AM. Chaperone-mediated autophagy: molecular mechanisms and physiological relevance[J]. Semin Cell Dev Biol, 2010, 21(7): 719-726.

[9] Tanida I. Autophagosome formation and molecular mechanism of autophagy[J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 14(11): 2201-2214.

[10] Barth S, Glick D, Macleod KF. Autophagy: assays and artifacts[J]. J Pathol, 2010, 221(2): 117-124.

[11] Mehrpour M, Esclatine A, Beau I, et al. Overview of macroautophagy regulation in mammalian cells[J]. Cell Res, 2010, 20(7): 748-762.

[12] Shintani T, Klionsky DJ. Autophagy in health and disease: a doubleedged sword[J]. Science, 2004, 306(5698): 990-995.

[13] Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al. Autophagy fights disease through cellular self-digestion[J]. Nature, 2008, 451(7182): 1069-1075.

[14] Helin H, Mero M, Markkula H, et al. Pancreatic acinar ultrastructure in human acute pancreatitis[J]． Virchows Arch A Pathol Anat Histol，1980，387(3): 259-270．

[15] Watanabe O, Baccino FM, Steer ML, et al. Supramaximal caerulein stimulation and ultrastructure of rat pancreatic acinar cell:early morphological changes during development of experimental pancreatitis[J]. Am J Physiol,1984,246(4): G457-G467.

[16] Gukovsky I，Gukovskaya AS．Impaired autophagy underlies key pathological responses of acute pancreatitis[J].Autophagy, 2010, 6(3):428-429.

[17] Gukovsky I, Gukovskaya AS. Impaired autophagic flux mediates acinar cell vacuole formation and trypsinogen activation in rodent models of acute pancreatitis[J].J Clin Invest,2009, 119(11)：3340-3355.

[18] Sherwood MW, Prior IA, Voronina SG, et al. Activation of trypsinogen in large endocytic vacuoles of pancreatic acinar cells[J]． Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(13): 5674-5679.

[19] Hayashi-Nishino M, Fujita N, Ramaguchi A, et al. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation[J]. Nat Cell Biol, 2009, 11(12): 1433-1437.

[20] Ohmuraya M, Yamamura K. Autophagy and acute panereatids: a novel autophagy theory for trypsinogen activation[J].Autophagy,2008，4(8): 1060-1062.

[21] Mizushima N, Yamamoto A, Matsui M, et al. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker[J]. Mol Biol Cell, 2004, 15(3): 1101-1111.

[22] Gukovsky I, Pandol SJ, Gukovskaya AS. Organellar dysfunction in the pathogenesis of pancreatitis[J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 15(10):2699-2710.

[23] Gukovsky I, Pandol SJ, Mareninova OA, et al. Impaired autophagy and organellar dysfunction in pancreatitis[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2012, 27(Suppl 2): 27-32.

[24] Gukovskaya AS, Gukovsky I. Autophagy and pancreatitis[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012, 303(9): G993-G1003.

[25] Hashimoto D, Ohmuraya M, Hirota M, et al. Involvement of autophagy in trypsinogen activation within the pancreatic acinar cells[J]. J Cell Biol, 2008, 181(7): 1065-1072.

[26] Zhang L, Zhang J, Shea K, et al. Autophagy in pancreatic acinar cells in cerulein-treated mice: immunolocalization of related proteins and their potential as markers of pancreatitis[J]. Toxicol Pathol, 2014, 42(2): 435-457.

[27] Feng D, Park O, Radaeva S, et al. Interleukin-22 ameliorates cerulein-induced pancreatitis in mice by inhibiting the autophagic pathway[J].Int J Biol Sci,2012，8(2)：249-257.

[28] Yang S, Bing M, Chen F, et al. Autophagy regulation by the nuclear factor KB signal axis in acute pancreatitis[J].Pancreas,2012,41(3)：367-373.

[29] Eskelinen EL, Tanaka Y, Saftig P. At the acidic edge: emerging functions for lysosomal membrane proteins [J]. Trends Cell Biol,2003, 13(3): 137-145.

[30] Saftig P, Klumperman J. Lysosome biogenesis and lysosomal membrane proteins: trafficking meets function[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10(9): 623-635.

[31] Fehrenbacher N, Bastholm L, Kirkegaard-Sorensen T, et al. Sensitization to the lysosomal cell death pathway by oncogene-induced down-regulation of lysosome-associated membrane proteins 1 and 2[J] .Cancer Res, 2008, 68(16): 6623-6633.

[32] Mareninova OA, Sendler M, Malla SR, et al. Lysosome-associated membrane proteins (LAMP) maintain pancreatic acinar cell Homeostasis: LAMP-2-deficient mice develop pancreatitis[J]. Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 2015,1(6):678-694.

[33] Boonen M, Van Meel E, Oorschot V, et al. Vacuolization of mucolipidosis type II mouse exocrine gland cells represents accumulation of autolysosomes[J]. Mol Biol Cell, 2011, 22(8):1135-1147.

[34] Fortunato F, Bürgers H, Bergmann F, et al. Impaired autolysosome formation correlates with Lamp-2 depletion: role of apoptosis, autophagy, and necrosis in pancreatitis[J]. Gastroenterology, 2009,137(1): 350-360.

[35] Fortunato F, Kroemer G. Impaired autophagosomelysosome fusion in the pathogenesis of pancreatitis[J]. Autophagy, 2009, 5(6): 850-853.

[36] Saluja AK, Lerch MM, Phillips PA, et al. Why does pancreatic overstimulation cause pancreatitis [J]? Annu Rev Physiol, 2007,69(1):249-269.

[37] Wartmann T, Mayerle J, Kahne T, et al. Cathepsin L inactivates human trypsinogen, whereas cathepsin L-deletion reduces the severity of pancreatitis in mice[J]. Gastroenterology,2010,138(2):726-737.

[38] Dennemärker J, Lohmüller T, Müller S, et al. Impaired turnover ofautophagolysosomes in cathepsin L deficiency[J]. Biol Chem, 2010, 391(8):913-922.

[39] Beth L, Noboru M, Virgin HW. Autophagy in immunity and inflammation[J]． Nature，2011，469(7330): 323-335．

[40] Vojo D. Autophagy: an emerging immunological paradigm[J]． J Immunol，2012，189(1): 15-20.

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.06.017

上海市卫计委青年项目(2013Y145)；上海卫计委重点项目(201440027)；上海中医药大学“创新团队发展计划”；上海中医大中西医结合高原学科(面上)项目

200062 上海，上海中医药大学附属普陀医院普外科

奉典旭，Email：fdianxu@sohu.com

2015-11-13)