NSCLC对EGFR-TKI获得性耐药机制及其策略的研究进展*

黄 欢综述， 姚文秀审校

(1.广西医科大学研究生院， 南宁 530021; 2.四川省肿瘤医院肿瘤内科， 成都 610041)

NSCLC对EGFR-TKI获得性耐药机制及其策略的研究进展*

黄 欢1综述， 姚文秀2△审校

(1.广西医科大学研究生院， 南宁 530021; 2.四川省肿瘤医院肿瘤内科， 成都 610041)

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)的重要诊疗靶点，指南和专家共识首选表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)治疗EGFR敏感突变的晚期NSCLC。然而，有些EGFR敏感突变的患者使用一段时间的EGFR-TKI后疾病进展，即获得性耐药，这是治疗晚期NSCLC患者的难点之一。获得性耐药机制包括EGFR T790M突变，细胞间质上皮转化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,c-MET)扩增，上皮间质化(epithelial mesenchymal transition,EMT)及肿瘤干细胞机制等，但还有部分耐药机制尚不清楚。该文阐述了近年来NSCLC对EGFR-TKI的获得性耐药机制的研究进展及其克服EGFR-TKI耐药的新方法。

表皮生长因子受体； 非小细胞肺癌； 酪氨酸激酶抑制剂； 耐药

肺癌已成为发病率和死亡率均居世界第一的恶性肿瘤，其中最常见的肺癌类型为非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)。目前治疗NSCLC最有效的方法是手术,但部分患者初次诊疗时已失去手术机会。2003年以来，肺癌分子靶向治疗成为研究热点，如针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)靶点的靶向药物酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)治疗晚期初治EGFR敏感突变患者、晚期化疗失败或不能耐受化疗副反应的非小细胞肺癌患者疗效显著，目前批准使用的一线药物有吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼等[1]。然而，有些患者开始接受EGFR-TKI治疗时较敏感,但经过9～13个月[2]的无进展生存期(progress free survival,PFS)后出现耐药。研究其耐药的机制及其如何克服一代EGFR-TKI的耐药是目前的热门话题。EGFR-TKI耐药包括原发性耐药和获得性耐药。原发性耐药定义为患者初次使用EGFR-TKI类药物治疗时，症状无明显改善，也没有明显的生存获益。获得性耐药是指患者既往运用过EGFR-TKI治疗，至少缓解1个月后病情进展。获得性耐药的发生机制主要有EGFR T790M突变、细胞间质上皮转化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor,c-MET)扩增，上皮间质化(epithelial mesenchymal transition,EMT)及肿瘤干细胞机制等[3]。现就NSCLC对EGFR-TKI的获得性耐药机制及其克服EGFR-TKI获得性耐药的策略综述如下。

1 EGFR及EGFR-TKI作用机制

1.1 EGFR结构及功能

EGFR是受体酪氨酸激酶家族中的成员，其他成员还包括HER2(ErbB-2)、HER3(ErbB-3)和HER4(ErbB-4)，EGFR与相应配体激活后形成二聚体，发生自身磷酸化，进而激活下游信号通路，例如PI3K/Akt/mTOR和RAS/RAF/MAPK通路，而这些通路促使肿瘤细胞增殖及抗凋亡[4]。由于EGFR在癌细胞膜表面高度表达，且在肿瘤细胞的增殖分化中起着重要作用，因此被认为是肿瘤主要诊疗靶点[5]。早期研究表明EGFR信号通路的激活是通过EGFR基因扩增实现的。后来的研究发现：虽然EGFR突变和扩增都能发生在肿瘤组织中，但EGFR通路的激活不是EGFR基因扩增引起，而是EGFR基因突变引起。有EGFR基因突变的患者与没有发生突变的患者相比，预后是有差异的。在非小细胞肺癌中，常见的敏感突变包括19外显子的缺失突变和21外显子L858R错义突变[2]。

1.2 EGFR-TKI作用机制

EGFR-TKI出现是NSCLC患者的福音。EGFR-TKI作用机制是通过竞争性结合EGFR酪氨酸激酶区域的ATP位点，抑制受体自身磷酸化，抑制酪氨酸激酶活化，从而阻断肿瘤细胞周期进程，加速肿瘤细胞凋亡。目前临床上应用最多的EGFR-TKI有厄洛替尼和吉非替尼等。Chan等[6]研究吉非替尼对EGFR敏感突变的患者反应率为76.7%，而在EGFR野生型患者中反应率仅12.2%，提示吉非替尼是否对肺癌患者敏感取决于EGFR的基因表型。Tracy等[7]体外实验发现，吉非替尼对野生细胞株的IC50(半数抑制浓度)比突变细胞株高10倍，吉非替尼致野生型细胞株阻滞于细胞周期的G1期，而相同药物浓度下的吉非替尼可致敏感突变型细胞株凋亡，这都表明敏感突变型EGFR比野生型EGFR对吉非替尼更敏感。从2004年开始，EGFR的激活突变在胞内的酪氨酸激酶编码区(18～21外显子)、ATP结合位点附近陆续被鉴定出来[8-9]。最常见的敏感突变是19外显子(Del746-A750)的缺失突变和21外显子(L858R)的错义突变[10]。研究显示：在不吸烟、女性、腺癌患者中,EGFR敏感突变率较高[11]。在东亚患者中这一比例有30%～40%,而在中国，这一比例达到了47.6%[12]。

2 EGFR-TKI获得性耐药及策略

2.1 T790M突变

在EGFR突变的NSCLC中，吉非替尼、厄洛替尼可以达到明显的疗效，但治疗后9～13个月后发生的耐药明显限制了患者生存时间[2]。对耐药分子和细胞机制深入了解是克服耐药的关键。目前研究最热门的获得性耐药机制是EGFR20外显子T790M的突变。20外显子会发生点突变，点突变集中在第790位密码子，EGFR晶体结构模型揭示野生型T790位于激酶催化域的ATP连接口袋,在这里形成了一个关键的氢键使得T790位点与靶向药物连接。该位置上出现一个从胞嘧啶核苷(C)到胸腺嘧啶核苷(T)的改变,在蛋白水平就是EGFR酪氨酸激酶功能域790位点的苏氨酸被蛋氨酸取代(T790M),这种突变可使EGFR重新处于被激活状态,从而降低吉非替尼等EGFR-TKI的作用[13]。T790M突变不仅会消除野生型EGFR的催化活性,可能也影响了激酶的活性或改变了突变型EGFR底物的专一性,从而使带有突变的肿瘤细胞更具有增殖活性。患者治疗前检测出对药物敏感的EGFR基因突变,但在使用吉非替尼一段时间后,病情继续恶化,通过对化疗后的肿瘤组织分析证实,患者出现了“获得性”T790M突变[14]。这提示,存在EGFR-TKI敏感相关突变基因的患者,在药物治疗过程中也可能产生耐药突变基因的亚克隆,加强对这些耐药突变的检测有助于及时判断疗效,选择最佳治疗方案。

AZD9291是由阿斯利康公司研发的第三代EGFR-TKI。作为对EGFR有选择性的不可逆EGFR-TKI，该药可同时对EGFR敏感突变和T790M突变产生较强抑制作用[15]。2014年，美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology,ASCO)公布的AZD9291 Ⅰ期临床结果显示：AZD9291对经EGFR-TKI治疗伴T790M突变的NSCLC患者的总反应率为64%，总体疾病控制率达到惊人的96%，并显著延长T790M突变患者的中位无进展生存期[16]。2015年11月，美国食品与药品管理局(Food and Drug Administration,FDA)加速批准AZD9291(Osimertinib)(80mg/d)作为EGFR T790M突变阳性的转移性NSCLC的治疗[17]。CO-1686 (Rociletinib)是由美国克洛维斯肿瘤公司研发的作用于敏感突变及T790M突变型EGFR的不可逆EGFR-TKI。早期临床试验结果显示CO-1686对接受过EGFR-TKI治疗失败的NSCLC患者表现出较好的疗效和耐受性，CO-1686对T790M突变患者的客观缓解率为58%[18]。而随后的Ⅱ期临床试验显示其缓解率远低于之前所宣称的58%(只有28%～34%)，同时存在较多严重的不良事件，所以CO-1686的Ⅲ期临床试验也被迫提前终止[19]。HM-61713是韩国Hanmi制药公司研发的一种对EGFR选择性的不可逆EGFR-TKI，I期临床试验[20]结果显示：HM-61713对T790M突变的NSCLC患者相较无T790M突变患者有着更高的客观缓解率和疾病控制率，显著延长了T790M突变患者的无进展生存期。进一步研究[21]显示：虽然HM61713的不良反应和AZD9291相比差异没有统计学意义，但疗效较AZD9291稍差。

2.2 c-MET扩增

c-MET是一个原癌基因，能够编码酪氨酸激酶受体，扩增的MET受体磷酸化激酶避开被抑制的EGFR磷酸化激酶通路，从而对EGFR-TKI耐药[22]。c-MET基因扩增使得EGFR敏感突变的NSCLC对吉非替尼耐药是通过ErbB3(HER3)依赖的磷脂酰激酶-3(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)通路实现的，大约占EGFR-TKI获得性耐药的5%[23]。但最近Awad等[24]发现，在非小细胞肺癌中，MET基因扩增和c-MET高表达与MET第14外显子突变有关，因此，未来的临床试验可将NSCLC MET第14外显子突变作为重要的治疗靶点。

有研究表明[25]：厄洛替尼联用MET受体拮抗剂(MET Mab)治疗晚期NSCLC有效。然而，随后的Ⅲ期临床试验[26]并未能证实Ⅱ期试验结果。2014年ASCO公布的结果显示，MET MAb联合厄洛替尼较厄洛替尼组未能提高总生存(overall survival,OS)和无进展生存期(PFS)，相关实验也被迫终止。Tivantinib(ARQ 197)是一个MET受体酪氨酸激酶抑制剂，2015年公布的Ⅲ期临床研究结果显示：Tivantinib联合厄洛替尼治疗进展的局部晚期或转移性的非鳞非小细胞肺癌与厄洛替尼单药相比，联合治疗的不良反应能耐受，虽然能提高患者的PFS(中位PFS，3.6个月vs单药组1.9个月，P<0.001)，但未能显示OS的获益[27]。近期，一项I期临床研究公布，间变性淋巴瘤激酶抑制剂克唑替尼(同时也是MET抑制剂)联合dacomitinib(不可逆ErbB- 2抑制剂)治疗厄洛替尼或吉非替尼耐药的NSCLC患者的结果，只有一个患者达到部分缓解(partial remission,PR)，46%的患者疾病稳定(stable disease,SD)，而联合治疗中43%的患者出现了3～4级治疗相关不良反应。结果提示此联合治疗效果有限且具有较多不可耐受的毒性[28]。INC280是一种c-MET抑制剂，吴一龙教授在2016年的ASCO大会上报道了INC280联合吉非替尼治疗耐药后(cMET+)的NSCLC的扩大Ⅱ期临床结果： INC280联合吉非替尼治疗的耐受性良好，在EGFR-TKI耐药的患者中显示了较好的临床疗效，疾病控制率达到80%，cMET基因拷贝数越高的患者可能疗效更佳[29]。INC280有望成为克服c-MET相关耐药的突破性药物，值得期待。

2.3 PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10)表达失活

PTEN全称是与张力蛋白同源在10号染色体有缺失的磷酸酶基因，是一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，它能抑制PI3K通路的活性，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖[30]。PTEN表达失活后，凋亡通路被阻断，从而失去了对细胞生长的抑制作用。Sos等[31]的研究发现PTEN表达缺失是EGFR-TKI耐药的一个原因。进一步的体外实验显示H1650细胞株(含有EGFR20外显子缺失突变的NSCLC细胞株)同时存在PTEN缺失，也显示出对厄洛替尼耐药。在EGFR敏感突变细胞中，PTEN的缺失与Akt和EGFR的激活相关。

有研究者[32]用吉非替尼诱导敏感突变HCC827细胞株，使其产生耐药，获得了HCC827/GR细胞株(对吉非替尼耐药)，发现在耐药肺癌细胞株中MicroRNA-214(一个在肿瘤的发生、发展及耐药过程中起关键作用的小型RNA)的表达比未诱导耐药的HCC827细胞株高很多，同时PTEN基因的表达比敏感突变HCC827细胞株低。有中国学者发现，较高的MicroRNA-214基因表达和较低的PTEN表达的患者对EGFR-TKI反应较差,且OS也较短，随后进行的体外实验显示，上调PTEN表达并下调MicroRNA-214基因表达能逆转吉非替尼对NSCLC耐药[33]。

2.4 上皮向间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)

EMT是参与正常胚胎形成的一个过程。EMT是指上皮细胞在某些因素的作用下，失去了细胞间连接和黏附性(例如E-钙蛋白或γ-连接蛋白的丢失)，获得侵袭和转移的能力，成为具有间质细胞特性(纤连蛋白和波形蛋白表达增加)的细胞[34]。EMT使肿瘤细胞具有更强的侵袭性和转移能力,下调E-钙蛋白及上调波形蛋白或纤连蛋白的表达有一个共性，就是不管EGFR的状态如何，其对吉非替尼或厄洛替尼都显示出耐药性[35]。

一项随机Ⅱ期临床试验结果显示：可逆转肿瘤EMT的药物恩替诺特与厄洛替尼联合使用相较厄洛替尼单药能延长低表达E-钙黏蛋白的肺癌患者的总生存(OS 9.4个月vs 5.4个月，P=0.03)[36]。Buonato等[37]发现经MEK抑制剂司美替尼(Selumitinib)预处理的NSCLC细胞能逆转EMT，并能对EGFR-TKI敏感。针对EMT耐药需要更多的探索。

2.5 肺癌干细胞

肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)是肿瘤组织中存在的一小部分具有自我更新、多向分化、无限增殖、强致瘤能力的细胞[38]。科学家从肺癌细胞中分离出了肿瘤干细胞[39]。肺癌干细胞表面特异性抗原标记有ALDH、CD44、CD133等，利用流式细胞术可分选出具有干细胞特性的肺癌干细胞。肿瘤干细胞具有耐药性，经化疗药物处理后仍然能够存活下来，具有较强的克隆能力，高表达ALDH等肿瘤干细胞标记物[40]。有研究者用高浓度的吉非替尼诱导HCC827细胞株耐药，发现耐药细胞不仅存在EMT特征，还包含干细胞特性，包括ALDH1A1过表达，侧群细胞的富集和自我更新的能力。而ALDH1A1过表达又与吉非替尼获得性耐药相关[41]。

Arasada等[42]发现，用厄洛替尼处理EGFR敏感突变肺癌细胞株会导致ALDH表达升高，且克隆形成率增加，经分析是由于厄洛替尼激活了Notch3信号通路。这提示使用Notch3信号通路抑制剂与EGFR-TKI联合可能逆转EGFR-TKI耐药。水飞蓟素(Silibinin)是一种具有生物活性的黄酮木脂素，有研究发现[43]，Silibinin能够降低NSCLC中ALDH的表达，与厄洛替尼联合使用能逆转NSCLC的耐药[42]。

3 结 语

在提倡循证医学、精准医疗的时代，面对各种EGFR-TKI的耐药，我们需要更多、更严谨、更科学的实验和临床研究来指导临床治疗，以期尽量延长晚期肺癌患者的生命，提高患者的生活质量。再次活检明确耐药的分子机制显得尤为重要，未来的分子靶向治疗及耐药后的治疗仍需我们进一步的思考和探索。

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