耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床分离株的流行病学与耐药机制研究

张广慧，　曹雪萍，　俞　静，　刘　瑛，　葛　艳

(1. 同济大学医学院，上海 200092；2.上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092)

摘要：目的　了解耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌流行病学情况以及耐药机制，帮助临床合理使用抗菌药物，为控制医院感染提供依据。方法　收集耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌110株及敏感株6株，进行来源病区和标本种类的统计分析；应用重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)进行基因型分型；使用PCR检测β-内酰胺酶基因(OXA、IMP、VIM等)及外排泵编码基因(adeA、adeB、adeC、adeJ、adeG)的携带情况；采用实时荧光定量PCR对比耐药菌株与敏感菌株的外排泵基因表达量的差异。结果　110株菌株主要来自痰标本，重症监护病房(ICU)分离率最高； 所有菌株REP-PCR电泳图谱分为A～G 7型，110株耐药菌株均为A型，且均被检测到含有OXA-23、OXA-51基因，均未检测到含有OXA-24、OXA-58、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2基因；外排泵编码基因adeA、adeB、adeC、adeJ及adeG的阳性率均为100%；耐药菌株外排泵编码基因adeA、adeB、adeC表达量明显高于敏感菌株。结论　耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的流行型别基本相同，均为A型，应引起临床医护人员的高度重视；β-内酰胺酶基因(OXA-23、OXA-51)的表达以及外排泵基因(adeA、adeB、adeC)的过度表达与其对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性有关。

关键词：鲍曼不动杆菌；β-内酰胺酶；外排泵；重复序列聚合酶链反应；实时荧光定量聚合酶链反应

中图分类号：

耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床分离株的流行病学与耐药机制研究

张广慧1，曹雪萍2，俞静2，刘瑛2，葛艳1

(1. 同济大学医学院，上海 200092；2.上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092)

摘要：目的了解耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌流行病学情况以及耐药机制，帮助临床合理使用抗菌药物，为控制医院感染提供依据。方法收集耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌110株及敏感株6株，进行来源病区和标本种类的统计分析；应用重复序列聚合酶链反应(REP-PCR)进行基因型分型；使用PCR检测β-内酰胺酶基因(OXA、IMP、VIM等)及外排泵编码基因(adeA、adeB、adeC、adeJ、adeG)的携带情况；采用实时荧光定量PCR对比耐药菌株与敏感菌株的外排泵基因表达量的差异。结果110株菌株主要来自痰标本，重症监护病房(ICU)分离率最高； 所有菌株REP-PCR电泳图谱分为A～G 7型，110株耐药菌株均为A型，且均被检测到含有OXA-23、OXA-51基因，均未检测到含有OXA-24、OXA-58、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2基因；外排泵编码基因adeA、adeB、adeC、adeJ及adeG的阳性率均为100%；耐药菌株外排泵编码基因adeA、adeB、adeC表达量明显高于敏感菌株。结论耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的流行型别基本相同，均为A型，应引起临床医护人员的高度重视；β-内酰胺酶基因(OXA-23、OXA-51)的表达以及外排泵基因(adeA、adeB、adeC)的过度表达与其对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性有关。

关键词：鲍曼不动杆菌；β-内酰胺酶；外排泵；重复序列聚合酶链反应；实时荧光定量聚合酶链反应

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)01-0053-05R446.5

文献标志码：码：A

作者简介：张广慧，男，1969年生，学士，副主任技师，主要从事临床生化检验和微生物学检验工作。

通讯作者：葛艳，联系电话：021-65981591。

Abstract:ObjectiveTo understand the drug resistance mechanisms and epidemiology of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii in order to guide the rational use of antibiotics and to provide the reference for the control of nosocomial infections. MethodsA total of 116 Acinetobacter baumannii (110 carbapenem-resistant isolates and 6 carbapenem-sensitive isolates) isolated from clinical specimens were classified and analyzed according to endemic areas and specimen types. The isolates were analyzed by repetitive-sequence polymerase chain reaction (REP-PCR) for genotyping. Beta-lactamase genes (OXA, IMP, VIM and soon) and efflux pump-encoding genes (adeA, adeB, adeC, adeJ, adeG) were amplified by PCR. Real-time fluorescence quantitation PCR was performed to compare the expression level of the efflux pump-encoding genes in resistant and sensitive isolates. ResultsThe isolation rate of resistant isolates in intensive care unit (ICU) was the highest-level, and the isolates were mainly isolated from sputum. The genotype types of carbapenem-resistant and -sensitive Acinetobacter baumannii were classified into 7 categories by REP-PCR. All the carbapenem-resistant isolates were type A. OXA-23 and OXA-51 were positive in 110 carbapenem-resistant isolates. However, OXA-24, OXA-58, IMP-1, IMP-2, VIM-1 and VIM-2 could not be detected in all the isolates. The positive rates of the efflux pump-encoding genes (adeA, adeB, adeC, adeJ and adeG) were 100%. The expression level of efflux pump-encoding genes (adeA, adeB, adeC) in resistant isolates was significantly higher than that in sensitive isolates. ConclusionsThe main popular type of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii is type A. Clinical staff should pay attention to this phenomenon. The expression of OXA-23 and OXA-51 overexpression of adeA, adeB and adeC efflux pump-encoding gene may play an important role in carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii.

DOI[5]SHIBATA N, Y, YAMANE K, et al. PCR typing of genetic determinants for metallo-beta-lactamases and integrases carried by gram-negative bacteria isolated in Japan, with focus on the class 3 integron[J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(12):5407-5413. 10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.013

收稿日期：(2014-10-09)

Epidemiology and resistance mechanism study of carbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiZHANGGuanghui1,CAOXueping2,YUJing2,LIUYing2,GEYan1.(1.TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,XinhuaHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,China)

Key words:Acinetobacterbaumannii; beta-lactamase; Efflux pump; Repetitive-sequence polymerase chain reaction; Real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction

鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)是一种非发酵、需氧的革兰阴性球杆菌，是引起医院感染的常见条件致病菌，它可以导致尿路感染、伤口感染、医院获得性肺炎等,严重威胁患者的生命[1]。最近几年，引起医院感染的多重耐药鲍曼不动杆菌甚至是泛耐药鲍曼不动杆菌逐渐增多，治疗极为困难，严重感染或免疫力低下患者的感染率及死亡率都明显增高[2]，其中最为重要的就是对碳青霉烯类抗菌药物产生的耐药。2012年中国CHINET调查显示不动杆菌属细菌对亚胺培南和美罗培南的敏感率分别为41.9%和37.9%。还有研究表明，碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌感染使患者住院的额外成本明显增高[3]。因此，了解鲍曼不动杆菌的流行病学情况和耐药机制，有助于加强鲍曼不动杆菌感染的防控，保障广大患者的生命安全和健康权益。

材料和方法

一、材料

1．菌株来源收集上海交通大学医学院附属新华医院2012年2月至2013年11月临床分离的鲍曼不动杆菌共116株，其中对碳青霉烯类抗菌药物(亚胺培南、美罗培南)耐药的菌株110株，敏感株6株，全部菌株用Vitek 2 Compact(法国生物梅里埃公司)进行菌种鉴定及体外药物敏感性分析。

2．仪器及试剂聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增仪、台式高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；电泳仪、凝胶成像仪购自中国天能科技有限公司。荧光定量PCR扩增仪购自Agilent Stratagene公司； PCR扩增试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR GreenⅠ试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司；DNA Marker、Loading buffer购自TAKARA公司；DNA染色液(SYBR Safe DNA Gel Stain)为美国Invitrogen公司产品。

二、方法

1．模板制备采用煮沸法提取细菌DNA。 取300 μL双蒸水于离心管中，从血平板上刮取适量菌落制成菌悬液。100 ℃处理15 min，10 600×g离心5 min。上清液即为DNA模板，-20 ℃保存备用。

2．重复序列(repetitive-sequence, REP)-PCR流行病学检测引物P1:5′-IIIGCGCCGICATCA-GGC-3′，P2:5′-ACGTCTTATCAGGCCTAC-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系为25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，灭菌双蒸水 12.75 μL，2 mmol/L dNTPs mixture 5.0 μL，DNA模板 1 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1.0 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，5 U/μL Taq酶0.25 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性1 min，45 ℃退火1 min，65 ℃延伸8 min，进行循环35次；最后65 ℃延伸16 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像系统观察并照相。条带数目和位置完全相同者可判断为同一基因型。

4．β-内酰胺酶与外排泵基因检测用PCR检测OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2基因以及adeA、adeB、adeC、adeJ、adeG等外排泵编码基因。各基因的扩增引物见表1，PCR反应体系和扩增反应参数参照试剂盒说明书。

5．外排泵基因表达量检测选取20株耐药株与6株敏感株，37 ℃肉汤培养至对数生长期，提取细菌总RNA，逆转录得到cDNA作为模板，采用SYBR GreenⅠ试剂盒进行实时荧光定量PCR并分析数据。将检测所得各基因的Ct均值与相对应的rpoB的Ct均值相减进行标准化，得到校准后的ΔCt值，再将耐药菌株校准后的ΔCt值与敏感菌株校准后的ΔCt值相减得到ΔΔCt值，最后用2-ΔΔCt计算出耐药菌株外排泵编码基因的mRNA相对表达量。反应体系配制及操作步骤参考试剂盒说明书。溶解曲线的峰单一、锐利说明所测Ct值可信。

参考文献表1β-内酰胺酶基因PCR扩增引物序列引物引物序列预期长度(bp)OXA-23P15'-GATCGGATTGGAGAACCAGA-3'501[4]P25'-ATTTCTGACCGCATTTCCAT-3'OXA-24P15'-GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA-3'246[4]P25'-AGTTGAGCGAAAAGGGGATT-3'OXA-51P15'-TAATGCTTTGATCGGCCTTG-3'353[4]P25'-TGGATTGCACTTCATCTTGG-3'OXA-58P15'-AAGTATTGGGGCTTGTGCTG-3'599[4]P25'-CCCCTCTGCGCTCTACATAC-3'IMP-1P15'-ACCGCAGCAGAGTCTTTGCC-3'587[5]P25'-ACAACCAGTTTTGCCTTACC-3'IMP-2P15'-GTTTTATGTGTATGCTTCC-3'678[5]P25'-AGCCTGTTCCCATGTAC-3'VIM-1P15'-AGTGGTGAGTATCCGACAG-3'261[5]P25'-ATGAAAGTGCGTGGAGAC-3'VIM-2P15'-ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG-3'801[5]P25'-CTACTCAACGACTGAGCG-3'adeAP15'-GGGTGTGAT-TCAAAAGAAGTCGC-3'169[6]P25'-GAACCTTTTCAATGATACCTC-CG-3'adeBP15'-AAAGACTTCAAAGAGCGGAC-TA-3'623[7]P25'-TCACGCATTGCTTCACCC-3'adeCP15'-ACAATCGTATCTCGTGGACTC-3'361[6]P25'-TAGAAACTGGGTTATTGGGGT-3'adeJP15'-CCTATTGCACAATATCCAACGA-3'119[8]P25'-AGGATAAGTCGCAGCAATCG-3'adeGP15'-GTCCTGAAATGGTCGTTCGT-3'143[8]P25'-AGCTTCTGCTTGGCTAGATGA-3'rpoBP15'-TTCATCTAGCCAAGCAGAAG-3'200[9]P25'-CCTGCTAATGGTAGGGTTAAG-3'

结果

一、标本种类及来源统计分析

耐药菌株主要来源于痰标本，重症监护病房(intensive care unit，ICU)(包括外科ICU、急诊ICU等)分离率最高，达44.5%。见表2。

表2　耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌分类统计

二、流行病学基因分型

110株耐药鲍曼不动杆菌经REP-PCR扩增后，呈现出大约7个条带。110株耐药株均为同一型别，称之为A型，6株敏感株则为另外6种类型，分别为B、C、D、E、F、G型。见图1。

三、β-内酰胺酶和外排泵基因检测

110株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌经PCR检测发现OXA-23和OXA-51基因阳性率均为100%，所有菌株均未检测到OXA-24、OXA-58、IMP-1、IMP-2、VIM-1、VIM-2基因。外排泵基因检测显示20株耐药菌和6株敏感菌株中adeA、adeB、adeC、adeJ、adeG的阳性率均为100%。见图2、图3。

四、外排泵基因表达量的检测

20株耐药菌株和6株敏感菌株，用实时荧光定量PCR比较耐药菌株和敏感菌株基因表达量的差异。结果显示耐药菌株adeA、adeB、adeC的表达量显著高于敏感菌株，分别达到18.2、14.2、15.1倍。见图4。

注：M1为Wide Range DNA Marker(100~6 000 bp)；M2为λ-HindⅢ；A~G为基因型，A型1～14、17～20， B型15，C型16，D型21，E型22，F型23，G型24

图1鲍曼不动杆菌REP-PCR指纹图谱

注：M为DNA Marker DL2000；1、2为OXA-23阳性结果,3为阴性对照；4、5为OXA-51阳性结果,6为阴性对照

图2β-内酰胺酶基因电泳图谱

注： M为DNA Marker DL2000；1、2为rpoB阳性结果，3为阴性对照；4、5为adeC阳性结果,6为阴性对照；7、8为adeB阳性结果,9为阴性对照；10、11为adeA阳性结果,12为阴性对照

图3外排泵基因电泳图谱

图4　耐药鲍曼不动杆菌的外排泵编码基因相对表达量

讨论

鲍曼不动杆菌是引起医院感染的重要条件致病菌之一，其生存条件简单，分布范围广，非常容易在医院内流行，尤其在ICU中，其感染率有明显上升趋势[10]。ROCA等[11]在5个洲的75个国家进行了ICU感染的病原菌研究，鲍曼不动杆菌被列为最常见病原体的第5位。近年来，由于抗菌药物的广泛使用，医院感染鲍曼不动杆菌临床分离株出现多重耐药甚至是泛耐药的特征，给临床治疗带来极大困难。准确的种属鉴定、药物敏感性情况和基因分型对指导临床控制多重耐药菌的感染以及合理、有效地使用抗菌药物具有重大临床意义。

分析细菌同源性的方法有很多，脉冲场凝胶电泳是目前国际上公认的进行基因同源性分析的金标准方法，但该方法操作繁琐，不便用于大样本的分析。本研究采用基因组间重复非编码序列分型法(REP-PCR)对细菌的同源性进行分析，敏感性好，操作简单。结果显示新华医院内耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌以A型克隆播散为主，而敏感菌株的6种克隆型均与A型相差较大，说明可能有耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌暴发流行，需要引起临床医护人员的高度重视，已报告新华医院感染控制科采取相关措施，加强鲍曼不动杆菌感染的防控，防止其在医院内继续流行传播。统计分析显示本研究耐药鲍曼不动杆菌主要来源于痰液，且ICU的分离率最高。有研究表明鲍曼不动杆菌感染的危险因素包括严重的基础疾病、长时间住院、机械通气、留置导管、使用免疫抑制药物、前期经验性抗菌药物使用不当等[12-13]。ICU中的患者住院时间长，基础疾病严重，多数带有呼吸机、留置管或引流管，与上述危险因素相符。

引起鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的机制主要有4种：(1)β-内酰胺酶的产生；(2)外膜蛋白表达的下调或缺失；(3)青霉素结合蛋白的改变；(4)细菌膜上主动外排泵表达增强，将透入细菌的药物泵出菌体外。其中，β-内酰胺酶包括苯唑西林水解酶和金属酶，主要是OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58类酶和VIM、IMP等金属酶。外排泵表达增强也是鲍曼不动杆菌产生多重耐药的重要原因。RND型外排泵是研究最深入的、在鲍曼不动杆菌中被发现的外排泵家族，AdeABC、AdeIJK、AdeFGH均属于RND型外排泵。有学者报道，AdeABC外排泵过度表达可导致细菌对氨基糖苷类、β-内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素类、红霉素、黏菌素及溴化乙锭产生耐药；而AdeFGH可导致氯霉素、克林霉素、氟喹诺酮类、四环素类、磺胺类耐药；AdeIJK可导致β-内酰胺类、氟喹诺酮类、四环素类、氯霉素、噻肟单酰胺菌素类等耐药[9, 14-15]。

本研究结果显示，耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌临床分离株以携带OXA-23、OXA-51型等D类酶为主，与彭俊华等[16]研究结果相符，所有菌株均未检测到B类金属酶(VIM-1、VIM-2、IMP-1、IMP-2)。另外，耐药菌株的adeA、adeB、adeC外排泵基因表达量显著高于敏感菌株，表明adeA、B、C型外排泵过度表达对新华医院鲍曼不动杆菌多重耐药性的产生有一定作用。β-内酰胺酶基因(OXA-23、OXA-51)的表达以及外排泵基因(adeA、adeB、adeC)的过度表达是本研究耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的主要耐药机制。

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(本文编辑：姜敏)