口腔黏膜病外周血淋巴细胞亚群的观察及分析

吴静静，　陆逸彬，　黄齐杰，　姚玉亭，　顾文莉

(上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科，上海 200011)

口腔黏膜病外周血淋巴细胞亚群的观察及分析

吴静静，陆逸彬，黄齐杰，姚玉亭，顾文莉

(上海交通大学医学院附属第九人民医院检验科，上海 200011)

摘要：目的观察2种常见的口腔黏膜病——复发性阿佛他溃疡(RAU)和口腔扁平苔藓(OLP)患者外周血淋巴细胞亚群分类的变化，探讨其免疫学发病机制。方法用流式细胞术分析105例RAU患者、70例OLP患者和65名健康对照者的外周血淋巴细胞亚群(总T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+/CD8+、NK细胞、B细胞)，比较各指标的组间差异。结果与健康对照组相比，RAU组总T细胞和CD8+T细胞显著增加(P<0.05、P<0.01)，CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值和B细胞均显著减少(P<0.01、P<0.001、P<0.05)；而OLP组与健康对照组相比，CD8+T细胞显著降低(P<0.05)；RAU组的总T细胞和CD8+T细胞显著高于OLP组(P<0.01、P<0.001))，而CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值和NK细胞均显著低于OLP组(P<0.01、 P<0.001、P<0.05)。结论RAU和OLP患者多出现外周血淋巴细胞亚群百分率异常，细胞免疫功能紊乱，但二者的免疫状态存在差异，因此针对性的免疫干预将成为一项极具潜力的治疗措施。

关键词：淋巴细胞亚群；外周血；口腔黏膜病；复发性阿佛他溃疡；口腔扁平苔藓

中图分类号：

文章编号：1673-8640(2015)01-0036-04R446.63

文献标志码：码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.01.009

Abstract:ObjectiveTo observe the changes of lymphocyte subsets of peripheral blood in 2 common oral mucosa diseases, recurrent aphthous ulcer (RAU) and oral lichen planus (OLP), and to investigate their immunological pathogenesis. MethodsBy flow cytometry, the lymphocyte subsets (total T cells, CD4+T cells, CD8+T cells, CD4+/CD8, NK cells and B cells) in the peripheral blood of patients with RAU (105 cases), OLP (70 cases) and healthy controls (65 cases). The difference was analyzed comparatively between the groups. ResultsCompared with healthy controls, total T cells and CD8+T cells in RAU group increased (P<0.05, P<0.01), but CD4+T cells, CD4+/CD8+and B cells decreased in RAU group (P<0.01, P<0.001, P<0.05). In addition, CD8+T cells in OLP group were lower than those in control group (P<0.05). The total T cells and CD8+T cells in RAU group were higher than those in OLP group (P<0.01, P<0.001), while CD4+T cells, CD4+/CD8+and NK cells in RAU group were significantly lower (P<0.01, P<0.001, P<0.05). ConclusionsOwing to the imbalanced lymphocyte subset percentages, the cellular immune function of patients with RAU or OLP is often found to be abnormal, but their immune states are not completely same. So, the application of selective immunologic intervention may be the promising therapeutic measure to those oral mucosa diseases.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81101642)

作者简介：吴静静，女，1992年生，硕士，主要从事肿瘤的免疫与分子生物学检验研究。

通讯作者：顾文莉，联系电话: 021-23271699-5810。

收稿日期：(2014-05-15)

Observation and analysis on lymphocyte subsets of peripheral blood in oral mucosa diseasesWUJingjing,LUYibin,HUANGQijie,YAOYuting,GUWenli.(DepartmentofClinicalLaboratory,theNinthPeople′sHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China)

Key words: Lymphocyte subset; Peripheral blood; Oral mucosa disease; Recurrent aphthous ulcer; Oral lichen planus

口腔黏膜病是临床常见的口腔疾病，发病率高，病变种类繁多，病损复杂多样，病程反复，严重影响患者的生活和工作，目前临床治疗以控制症状为主，难以根治，被列为口腔疾病的重大难题之一。该病致病因素众多，发病机制复杂，迄今研究者普遍认为机体免疫功能失衡在疾病发生、发展过程中占有重要地位，但病变类型不同，所涉及的免疫功能改变也不尽相同，治疗措施迥异。我们以2种常见的口腔黏膜疾病——复发性阿佛他溃疡(recurrent aphthous ulcer,RAU)和口腔扁平苔藓(oral lichen planus, OLP)为例，比较相应患者免疫功能的改变，探讨其免疫发病机制的差异，为指导有效的临床治疗提供客观依据。

材料和方法

一、病例选择

本研究共设立3个观察组：口腔黏膜病组(RAU组和OLP组)以及健康对照组。口腔黏膜病组来自2013年7至12月在上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔黏膜科就诊的患者，参照《口腔黏膜病学》(第3版)中有关RAU和OLP的诊断标准[1]，根据患者的临床表现和病理特征确诊，其中RAU组105例，男56例，女49例，年龄(43±13)岁；OLP组70例，男28例，女42例，年龄(47±12)岁。所有患者均排除其他自身免疫性疾病和长期服药的系统性疾病，且近3个月内未曾接受任何免疫治疗。健康对照组65名，男24名，女41名，年龄(43±10)岁，全部为上海交通大学医学院附属第九人民医院健康体检者，无任何口腔黏膜疾病、自身免疫性疾病和其他长期服药的系统性疾病，且年龄及性别组成与口腔黏膜病组相似。

二、仪器试剂

BD FACSCalibur流式细胞分析仪和配套的Multitest IMK 试剂盒 (美国BD公司)。

三、方法

口腔黏膜病组和健康对照组病例均采集空腹静脉血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝。取50 μL 抗凝全血分别加入20 μL CD3/CD8/CD45/CD4试剂和20 μL CD3/CD16CD56/CD45/CD19试剂，室温避光孵育15 min后，各加入300 μL溶血素，再室温避光孵育15 min，混匀，上流式细胞仪检测。检测指标包括：总T淋巴细胞(CD3+)、辅助/诱导性T淋巴细胞(CD3+CD4+)、抑制/细胞毒T淋巴细胞(CD3+CD8+)、B淋巴细胞(CD3-CD19+)、NK细胞(CD3-CD16+CD56+)的分类百分率以及CD4+/CD8+细胞的比值。

四、 统计学方法

结果

与健康对照组相比，RAU组总T细胞、CD8+T细胞显著增加(P<0.05、P<0.01)，CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值、B细胞显著减少(P<0.01、P<0.001、P<0.05)；NK细胞虽有减少的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。而OLP组与健康对照组相比，CD8+T细胞显著降低(P<0.05)，；CD4+/CD8+比值虽有增加，但差异无统计学意义 (P>0.05)。RAU组的总T细胞和CD8+T细胞显著高于OLP组(P<0.01、P<0.001)，而CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值和NK细胞显著低于OLP组(P<0.01、P<0.001、P<0.05)。见表1和图1。

表1不同口腔黏膜病患者外周血淋巴细胞亚群分类比较

组别例数总T细胞(%)CD4+T细胞(%)CD8+T细胞(%)CD4+/CD8+B细胞(%)NK细胞(%)健康对照组6567.11±7.5437.23±6.3426.51±6.901.53±0.5712.42±3.1418.95±7.05RAU组10570.10±7.72*34.29±6.80**30.35±8.00**1.24±0.55***11.13±3.71*17.88±7.93OLP组7066.14±9.90##38.29±8.73##23.31±6.77*###1.82±0.88###11.61±4.2921.07±10.10#

注：与健康对照组比较，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；与RAU组比较，#P<0.05、##P<0.01、###P<0.001

图1　3组外周血淋巴细胞亚群分类比较

讨论

RAU 是以复发性、周期性、自限性为特点的口腔黏膜灼痛性溃疡，人群发病率高达20%，居口腔黏膜疾病的首位。其病因复杂，机制未明，但研究者普遍认为免疫因素与RAU的发病密切相关。正常情况下，机体内淋巴细胞各亚群之间保持一定比例，维持适度的免疫应答。但在某种诱因作用下，免疫稳态被破坏，造成局部免疫损伤，导致口腔溃疡的发生。1969年研究者首次发现RAU患者病损处有大量T淋巴细胞浸润，其中溃疡前期和愈合期以CD4+T细胞为主，而溃疡期则以CD8+T细胞为主，提示T淋巴细胞在RAU发病过程中存在异常的调节机制。而张华昌等[2]研究发现在RAU患者外周血中CD4+、CD8+T细胞及CD4+/CD8+变异率与正常组差异有统计学意义(P<0.05)。

本研究结果显示RAU患者体内存在明显的T淋巴细胞分类异常，如总T细胞、CD8+T细胞增加，CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值明显减少。这种细胞亚群比例的失调，可引起全身或局部的免疫功能紊乱。如CHAVAN等[3]对RAU活检组织做组化染色时发现，溃疡期溃疡局部CD8+T细胞占多数，这便是机体免疫状态在局部的表现之一，结果是机体或局部细胞免疫功能受到影响，增强了细胞对各种非特异性和特异性致病因子的易感性，较易发生口腔黏膜上皮的完整性损伤，导致溃疡产生。本研究印证了RAU患者体内存在淋巴细胞亚群的比例失衡，而由此形成的免疫功能异常可能是RAU发病过程的重要环节。此外，有研究者还发现，RAU患者溃疡局部CD4+T细胞亚群功能也存在异常，Th1细胞活跃，导致其分泌的相关基因，如γ干扰素(interferon gamma，IFN-γ)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白细胞介素15(interleukin，IL-15)等表达上调，而Th2细胞相关基因表达无明显改变[4]，由此导致的局部免疫功能异常可能也参与RAU的发病过程。

此外，本研究还发现RAU组B细胞显著减少，这与SISTIG等[5]的结果完全一致。据此推测在RAU患者体内除了存在T细胞免疫功能异常外，B细胞主导的体液免疫功能也可能存在缺陷。吴慧华等[6]发现RAU患者唾液中SIgA的含量较正常组低。但相关研究结果不尽相同，MOHAMMAD等[7]发现RAU急性期唾液IgA水平显著高于缓解期和健康对照人群，与SALUJA等[8]的报道类似。分析原因，可能如研究者所述，与临床诊断标准、选取病例的临床分类及检测方法的敏感性不同有关。鉴于机体全身或局部的适应性免疫应答都有可能受到不同程度的波及，若再加上某些诱因，如在病毒感染、精神紧张、疲劳、维生素或微量元素缺乏、激素水平改变等作用下，患者就会最终出现反复发作的口腔溃疡。

至于NK细胞在RAU患者中的变化，主要反映固有免疫在RAU发病中的作用，至今文献报道各不相同。SISTIG等[5]发现NK细胞活力在RAU急性期和缓解期均下降，而伍江慧等[9]则证实NK细胞活性在RAU发作期显著提高。这些结果提示NK细胞的活性改变可能与RAU的发病有关。本研究主要关注NK细胞的相对数量，结果发现其与正常组间并无差异，但其活力如何变化还有待进一步探讨。

OLP也是一种常见的口腔黏膜慢性炎症性疾病，其主要病理改变是基底细胞液化变性及上皮下淋巴细胞浸润，但发病机制尚未完全明确。目前有研究者认为OLP是一种由自身细胞毒性T淋巴细胞引发上皮细胞凋亡所导致的慢性炎性疾病[10]。在OLP病损处浸润着大量的T淋巴细胞，且毗邻受损基底细胞处的T淋巴细胞大部分为活性CD8+T细胞，而受损基底膜区域的CD4+T细胞并未增加[11]，而且由OLP损害区分离出的CD8+T细胞克隆显示出了对自体同源角质细胞的细胞毒性活性[12]。提示激活的CD8+细胞毒性T细胞可启动对基底膜角质形成细胞的杀伤作用，最终导致口腔黏膜的损伤。

本研究主要关注OLP组患者外周血中T淋巴细胞亚群的变化，结果表明与健康对照组相比，OLP组CD8+T细胞显著降低，这与PEKINER等[13]的报道一致。而其他如总T细胞、CD4+T细胞、CD4+/CD8+细胞比值均无统计学差异。至于CD8+T细胞的减少，可能是由于大量具有免疫活性的CD8+细胞毒性T细胞从循环血液转移到损伤部位发挥效应所致。而CD4+T细胞虽然量未发生变化，但其本身也是多组分的细胞群体，如Th1、Th2、Th17、调节性T细胞等，它们各自在OLP中的组成变化还有待进一步研究。潘玉霞等[14]曾关注OLP与Th1/Th2平衡之间的关系，认为患者体内细胞因子表达格局发生变化，其中病损组织局部Th1型细胞因子占优势地位，而外周血中则以Th2型细胞因子为主，这可能与其发病机制有关。

目前有关OLP患者体内淋巴细胞亚群变化的报道不断出现，虽然结论不一致，但存在共同趋势，即患者体内大多存在淋巴细胞亚群分布或功能紊乱。至于结果间的差异，原因可能是选取研究对象间的差异，如病情轻重、病程长短、疾病活跃程度、病变部位等。研究观察指标不同也会影响结果判断，如细胞数量与活性之间的关系，因为有报道OLP患者外周血淋巴细胞亚群虽然数量减少，但活性仍能保持[13]。另外，不同的检测方法也是造成结果差异的原因之一，如方法的敏感性、特异性、干扰因素及局限性等都可能影响最终的结果判断。我们推测正是由于上述诸多原因造成本研究结果与其他研究结论[15-16]不尽相同。

众所周知，RAU和OLP这2类常见的口腔黏膜病都和患者异常的免疫功能密不可分，但二者免疫状态的变化趋势及发病机制并不相同。本研究比较这2组患者外周血中淋巴细胞亚群，发现RAU组的总T细胞、CD8+T细胞显著高于OLP组，而CD4+T细胞、CD4+/CD8+比值和NK细胞显著低于OLP组，结果印证了2种疾病所呈现的不同的免疫状态。CD4+T细胞(即诱导性/辅助性T细胞)启动免疫反应，CD8+T细胞(即抑制性/细胞毒性T细胞)调控免疫反应，二者维持平衡可保证机体正常的免疫应答；若比例异常，机体可出现免疫功能的紊乱和相应的临床症状。RAU患者体内CD3+、CD4+及CD4+/CD8+比值偏低，这种免疫缺陷状态可增加黏膜上皮对各种非特异性和特异性致病因子的易感性，导致溃疡反复发作。而OLP发病机制则有所不同，目前普遍认为它是一种T细胞介导的自身免疫性疾病，在其发病过程中，抗原特异性机制和非特异性机制都有所涉及，其中T淋巴细胞介导的细胞毒性作用引发角质形成细胞的凋亡被认为是其发病机制中最主要的环节。

综上所述，RAU与OLP患者体内虽然都存在免疫功能的紊乱，但二者的免疫发病机制及病理变化不尽相同。本研究从外周血淋巴细胞亚群分类变化的角度，进一步证实2种常见的口腔黏膜疾病存在各自特征性的免疫功能紊乱。因此在临床治疗时不能一概而论，必须根据患者不同的免疫状态，有针对性地采取免疫干预措施，改善患者失衡的免疫状态，以便取得更好的治疗效果。

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(本文编辑：姜敏)