鸡腿菇复合制剂对小鼠肝脏的保护作用

刘　芹1,耿雪冉2,许瀛引2,柳万石,王贺祥

(1.河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，河南郑州　450002；

2.中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京　100193；

3.金亨稷师范大学，平壤　999093)

鸡腿菇复合制剂对小鼠肝脏的保护作用

刘芹1,耿雪冉2,许瀛引2,柳万石2,3,王贺祥2*

(1.河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，河南郑州450002；

2.中国农业大学农业生物技术国家重点实验室，北京100193；

3.金亨稷师范大学，平壤999093)

摘要：探讨鸡腿菇复合制剂的护肝作用，为鸡腿菇复合制剂的推广应用提供理论基础.通过对昆明小鼠灌胃不同剂量的鸡腿菇复合制剂，测定小鼠的转氨酶(GOT，GPT)、丙二醛(MDA)、抗氧化酶(SOD，GSH-PX)水平,观察肝脏的组织病理变化，研究鸡腿菇复合制剂对CCl4造成的急性肝损伤小鼠肝脏的保护作用.结果表明,灌胃鸡腿菇复合制剂可明显降低血清中转氨酶(GOT,GPT)和肝脏中丙二醛(MDA)的水平(P<0.05)，提高肝脏中抗氧化酶(SOD,GSH-PX)的水平.病理组织切片显示，造模小鼠肝组织存在大面积坏死区域和脂滴累积，鸡腿菇复合制剂在低、中、高三个剂量时均可减轻肝组织受损程度，其中低剂量的效果更为明显，说明鸡腿菇复合制剂对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝脏具有明显的保护作用.

关键词：鸡腿茹复合制剂；CCl4；肝脏；保护

收稿日期：2015-06-11;修改稿收到日期:2015-07-12

*通讯联系人，男，教授，博士.主要研究方向为药用与食用真菌.E-mail:hxwang@cau.edu.cn

E-mail:liuqin_bio@163.com

基金项目:现代农业产业技术体系建设专项基金(CARS-24)

作者简介：刘芹(1986—)，女，河南永城人，博士.主要研究方向为药用与食用真菌.

中图分类号：R 965

文献标志码：标志码：A

文章编号：章编号：1001-988Ⅹ(2015)06-0083-05

Abstract:The hepatoprotective potential of Coprinus comatus-compound is discussed in vivo using a hepatotoxicity model of CCl4-induced liver injury.Neutralization of CCl4-induced hepatotoxicity by Coprinus comatus-compound is evaluated in mice.Towards this,serum levels of hepatic injury markers(glutamic-oxaloacetic transaminase and glutamic-pyruvic transaminase),malondialdehyde and antioxidant enzymes (superoxide dismutase and glutathione peroxidase) in the liver homogenates,and histological examination are performed.The results show that administration of Coprinus comatus-compound can significantly prevente the elevation in serum glutamic-oxaloacetic transaminase(GOT) and glutamic-pyruvic transaminase(GPT) activities in acute liver damage induced by CCl4 and suppressed hepatic malondialdehyde(MDA) formation.Mice treated with Coprinus comatus-compound is demonstrated a better profile of antioxidants with augmented activities of superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase(GSH-PX) in the liver.The results indicate that Coprinus comatus-compound has significant protective effect against acute hepatotoxicity induced by CCl4,and has been supported by the evaluation of liver histopathology in mice.

TheprotectiveeffectofCoprinus comatus-compound

onCCl4-induced acute liver injury of mice

LIUQin1,GENG Xue-ran2,XU Ying-yin2,RYN Mansok2,3,WANGHe-xiang2

(1.InstituteofPlantNutritionandResourceEnvironment,HenanAcademyofAgriculturalSciences,

Zhengzhou450002,Henan,China;

2.StateKeyLaboratoryforAgrobiotechnologyandDepartmentofMicrobiology,ChinaAgriculturalUniversity,

Beijing100193,China;

3.D.P.R.KoreaPyongyangKimHyongJikUniversityofEducation,Pyongyong999093,NorthKorea)

Keywords:Coprinus comatus-compound;CCl4;liver;protection

肝脏是人体最大、功能最复杂的实质性腺体，参与消化、代谢、解毒和免疫等多个过程[1].各种致病因子如机械损伤、病毒感染、化学毒物(CCl4、酒精等)、寄生虫感染以及高脂食物等均能引起肝细胞受损，导致肝脏疾病发生[2].近年来对化学性肝损伤有保护作用的天然药物的研究备受关注，显示了天然药物抗肝损伤、护肝降酶的美好前景[3,4].鸡腿菇复合制剂主要是由鸡腿菇等多种食用菌及中草药组成，是一种功能性食品，由于其具有作为天然药物的潜力，目前正处于研究和申报阶段.本研究利用CCl4建立肝损伤模型，探究此制剂对小鼠肝脏的保护作用及其可能的机制，为其进一步开发为天然药物提供理论基础.

1材料和方法

1.1药品及主要试剂

鸡腿菇复合制剂由苏州佛果生物科技有限公司提供，主要成分为鸡腿菇、猴头菇、金针菇、草菇、香菇、茯苓、人参、枸杞子、佛手等.

谷草转氨酶(Glutamicoxalacetictransaminase，GOT)、谷丙转氨酶(Glutamatepyruvatetransaminase，GPT)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GSH-PX)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所,四氯化碳购自北京化工厂,水飞蓟素胶囊来自德国马博士大药厂.

1.2方法

1.2.1实验动物 雄性昆明小鼠，体重18～22g，由北京兴隆实验动物养殖厂提供.动物实验设施持续保持屏障环境标准.主要控制温度(25±2)℃，相对湿度55%±5%，光照明∶暗 = 12h∶12h.动物饲养在标准盒内，每周两次更换垫料和笼具，保持盒内环境清洁干燥，每日添加饲料和饮水，保持动物自由饮食活动.实验遵循中国农业大学实验动物道德规范.

1.2.2动物实验及指标检测 取雄性成年昆明小鼠54只，随机分成正常对照组、阴性对照组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组.正常对照组不做任何处理，阴性对照组给予生理盐水(20ml·kg-1·d-1,ig)，阳性对照组灌胃给药水飞蓟素(200mg·kg-1·d-1，ig)，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别灌胃770,1 540,3 080mg·kg-1·d-1的鸡腿菇复合制剂.连续给药10d后，除正常对照组外各组均灌胃CCl4的花生油溶液(1%，5mL·kg-1，ig)[5,6].禁食不禁水16h后，将小鼠摘除眼球取血，5 000r·min-1离心10min，取血清.按照试剂盒操作方法，检测血清中GOT和GPT的水平.分离小鼠的肝脏，用冰生理盐水制备肝脏匀浆(10%，w/v)，8 000r·min-1，4 ℃，离心10min，按照试剂盒操作方法，检测血清中的MDA含量和SOD、GSH-PX活性.同时取肝脏左小叶组织，保存在10%中性福尔马林溶液中，用于肝脏组织病理学检查.

1.2.3肝脏组织病理学检查上述固定的各组小鼠肝组织块，系列乙醇脱水，常规石蜡包埋、切片(4μm)，H&E染色，生物显微镜观察.

1.3统计学分析

2结果

2.1鸡腿菇复合制剂对小鼠血清GOT和GPT活性的影响

与正常对照组相比，CCl4造模后的小鼠血清GOT、GPT水平明显上升，与正常对照组相比均有极显著的差异(P<0.01)，说明模型成功.与阴性对照组相比，灌胃低、中、高三个剂量的鸡腿菇复合制剂均可明显降低血清中GOT和GPT活力(P<0.05)，尤其是灌胃低剂量的鸡腿菇复合制剂后，小鼠血清中的GOT、GPT活力有更明显的降低趋势(P<0.01)(表1).

表1　鸡腿菇复合制剂对小鼠血清GOT和GPT活性的影响

#P<0.05,##P<0.01；与正常对照组比较(compared with normal control);*P<0.05,**P<0.01与阴性对照组比较(compared with negative control)

2.2鸡腿菇复合制剂对小鼠肝脏MDA含量和SOD、GSH-PX活性的影响

与正常对照组相比，造模后的小鼠肝脏MDA水平明显上升，差异极显著(P<0.01)，灌胃低、中、高三个剂量的鸡腿菇复合制剂均可降低肝脏MDA的水平(P<0.05).造模后小鼠肝脏中抗氧化酶SOD和GSH-PX水平与正常对照组相比明显下降，差异极显著(P<0.01)，低、中、高三个剂量的测试样品均有提高SOD和GSH-PX水平的作用,尤其是低剂量组与模型组相比有显著性差异(P<0.05,表2).

表2　鸡腿菇复合制剂对小鼠肝脏MDA含量和SOD、GSH-PX活性的影响

#P<0.05,##P<0.01；与正常对照组比较(compared with normal control);*P<0.05,**P<0.01与阴性对照组比较(compared with negative control)

2.3肝组织病理学变化

组织病理切片显示,正常组的小鼠肝脏组织完好,肝细胞完整,形状规则,排列紧密、均一,细胞核正常(图1：A).阴性对照组小鼠肝脏严重受损,表现为大面积坏死区域和脂滴累积(图1：B).阳性药物水飞蓟素能明显改善CCl4对肝细胞的毒害作用,使肝细胞基本恢复正常(图1：C).鸡腿菇复合制剂的低、中、高三个剂量均可减少肝脏受损害的程度，尤其是低剂量的效果更为明显，基本无肝细胞脂肪变性和坏死(图1：D～F),这说明鸡腿菇复合制剂对CCl4所致急性肝损伤小鼠有较好的保护作用.

3讨论

肝脏在维持人体健康中有着十分重要的地位.CCl4造成的肝损伤主要是因为其经肝线粒体细胞色素P450作用后生成的三氯甲烷自由基可与蛋白质共价结合导致蛋白质合成障碍以及脂质分解代谢紊乱，从而引起肝细胞内甘油三酯累积.同时三氯甲烷自由基与O2结合生成的过氧化三氯甲烷自由基会导致脂质过氧化，破坏细胞膜结构，最终导致肝细胞无法正常代谢而死亡[3,5,7].

血清GOT和GPT活力水平是反应肝损伤的灵敏指标，其水平的高低与肝脏受损的程度一致[3].正常情况下，GOT和GPT主要存在于肝细胞中，血清内含量很低，而当肝细胞受到损害时，这些酶会从细胞中释放出来而进入血循环中[8-10].本实验中CCl4造模后小鼠血清GOT、GPT活力水平明显上升，与正常对照组相比均有极显著的差异.而鸡腿菇复合制剂在低、中、高三个剂量下都可以降低血清GOT和GPT活力水平，说明鸡腿菇复合制剂具有保护肝脏的作用.

MDA是脂质过氧化的代谢产物，常用作脂质过氧化的指标.MDA能够进入膜脂的水相，与膜蛋白、膜磷脂上的-NH2交联形成Schiff碱，从而导致细胞膜变硬，流动性减低，通透性增加，从

图1　 鸡腿菇复合制剂对小鼠肝组织结构的影响(×400)

A.正常对照组;B.阴性对照组;C.阳性对照组;D.低剂量组;E.中剂量组;F.高剂量组

A.normal control group;B.negative control group;C.positive control group;D.low-dose group;E.middle-dose group;F.high-dose group.

而使膜的功能受损或降低，故而通过检测其水平的高低可以反映机体氧化损伤的程度[2,3].SOD是生物体内清除自由基、抑制自由基反应的物质之一，它可以催化超氧阴离子还原成过氧化氢和氧气从而终止自由基链式反应，对机体细胞氧化损伤具有很强的防御功能[11,12].GSH-PX是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，它特异的催化过氧化氢还原为水和氧气，具有保护细胞膜结构和功能完整的作用，而在肝损伤发生的过程中，可以起到减轻肝细胞膜损害的作用[8,13].抗氧化酶SOD和GSH-PX组成了防止氧化损伤的第一道防线，其水平的高低直观地反映了组织的氧化应激能力[14].本实验中灌胃鸡腿菇复合制剂可以拮抗CCl4造成的肝脏MDA水平的升高以及抗氧化酶SOD和GSH-PX活力水平的降低，同时结合组织病理学检查结果可知，鸡腿菇复合制剂对CCl4所致的急性肝损伤小鼠的肝脏具有明显的保护作用，并且其保肝作用可能是通过增强机体内源性抗氧化防御系统，有效地拮抗CCl4所致的抗氧化酶活性降低，从而抑制自由基介导的脂质过氧化反应来实现[15,16].

4结论

根据文献报道及本实验的预实验，建立了小鼠的CCl4急性肝损伤模型，实验模型组转氨酶和MDA水平明显高于正常对照组，且抗氧化酶SOD和GSH-PX活力水平较正常对照组明显降低也证实了模型的可信度.在本实验条件下，鸡腿菇复合制剂尤其是在低剂量下可以降低血清转氨酶及肝组织MDA的水平，同时提高抗氧化酶的水平，组织病理学检查也显示鸡腿菇复合制剂可以明显减轻CCl4对肝脏造成损害的程度，具有保护肝脏的作用.

参考文献:

[1]ALTAS S,KIZIL G,KIZIL M,et al.Protective effect of Diyarbakir watermelon juice on carbon tetrachloride-induced toxicity in rats[J].FoodChemToxicol,2011,49(9):2433.

[2]LU X,ZHAO Y,SUN Y,et al.Characterisation of polysaccharides from green tea of Huangshan Maofeng with antioxidant and hepatoprotective effects[J].FoodChem,2013,141(4):3415.

[3]CHENG N,REN N,GAO H,et al.Antioxidant and hepatoprotective effects ofSchisandrachinensispollen extract on CCl4-induced acute liver damage in mice[J].FoodChemToxicol,2013,55:234.

[4]KEPEKCI R A,POLAT S,CELIK A,et al.Protective effect ofSpirulinaplatensisenriched in phenolic compounds against hepatotoxicity induced by CCl4[J].FoodChem,2013,141(3):1972.

[5]HUANG G J,DENG J S,HUANG S S,et al.Hepatoprotective effects of eburicoic acid and dehydroeburicoic acid fromAntrodiacamphoratain a mouse model of acute hepatic injury[J].FoodChem,2013,141(3):3020.

[6]KIM Y,YOU Y,YOON H G,et al.Hepatoprotective effects of fermentedCurcumalongaL on carbon tetrachloride-induced oxidative stress in rats[J].FoodChem,2014,151:148.

[7]GAN D,MA L,JIANG C,et al.Medium optimization and potential hepatoprotective effect of mycelial polysaccharides fromPholiotadinghuensisBi against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice[J].FoodChemToxicol,2012,50(8):2681.

[8]JIANG C,XIONG Q,GAN D,et al.Antioxidant activity and potential hepatoprotective effect of polysaccharides fromCyclinasinensis[J].CarbohydrPolym,2013,91(1):262.

[9]LIU Q,TIAN G,YAN H,et al.Characterization of polysaccharides with antioxidant and hepatoprotective activities from the wild edible mushroomRussulavinosaLindblad[J].JAgricFoodChem,2014,62(35):8858.

[10]HUANG G J,DENG J S,HUANG S S,et al.Protective effect of antrosterol fromAntrodiacamphoratasubmerged whole broth against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice[J].FoodChem,2012,132(2):709.

[11]ZHAO W,LI J J,YUE S Q,et al.Antioxidant activity and hepatoprotective effect of a polysaccharide from Bei Chaihu(BupleurumchinenseDC)[J].CarbohydrPolym,2012,89(2):448.

[12]YU J,CUI P J,ZENG W L,et al.Protective effect of selenium-polysaccharides from the mycelia ofCoprinuscomatuson alloxan-induced oxidative stress in mice[J].FoodChem,2009,117(1):42.

[13]SABIR S M,AHMAD S D,HAMID A,et al.Antioxidant and hepatoprotective activity of ethanolic extract of leaves ofSolidagomicroglossacontaining polyphenolic compounds[J].FoodChem,2012,131(3):741.

[14]WANG D,ZHAO Y,JIAO Y,et al.Antioxidative and hepatoprotective effects of the polysaccharides fromZizyphusjujubecv.Shaanbeitanzao[J].CarbohydrPolym,2012,88(4):1453.

[15]SOARES A A,DE SA-NAKANISHI A B,BRACHT A,et al.Hepatoprotective effects of mushrooms[J].Molecules,2013,18(7):7609.

[16]TUNG Y T,WU J H,HUANG C C,et al.Protective effect ofAcaciaconfusabark extract and its active compound gallic acid against carbon tetrachloride-induced chronic liver injury in rats[J].FoodChemToxicol,2009,47(6):1385.

(责任编辑俞诗源)