HPLC—MS/MS法检测分离皮革和纺织品中有害芳香胺及其同分异构体

钟雪莲++++陆佳英++++胡燕琴

摘要：本文建立了HPLC—MS/MS法测定皮革、纺织品中有害芳香胺及其同分异构体的检测分离方法。样品按标准GB/T 17952—2011或者GB/T 19942—2006前处理方法完成样品的前处理之后，甲醇定容过滤后待HPLC—MS/MS上机分析测试，色谱柱为poroshell 120EC C18快速柱，流动相为甲醇和0.025mol/L的乙酸水溶液，在梯度洗脱程序下分离有害芳香胺及其同分异构体，质谱采用ESI源（Jet Stream ），外标法定量。该方法的定量下限为0.1mg/kg。标准中21种芳香胺的标准曲线线性相关系数大于0.99，线性范围为0.1mg/kg～20mg/kg。在5mg/kg和20mg/kg的两个添加水平的加标样做方法精密度的相对标准偏差（RSD）值均小于6%。

关键词：有害芳香胺；同分异构体；高效液相色谱—串联质谱法

随着欧盟禁用偶氮染料法规的发布和我国强制性国家标准《国家纺织产品基本安全技术规范》（GB 18401—2010）的实施，禁用偶氮染料检测方法越来越引起人们的重视，纺织品上禁用偶氮染料已经成为纺织品服装国际国内生产和贸易中最重要的监控指标[1-6]。目前我国专业检测机构检测纺织品、皮革制品中等禁用偶氮染料主要采用 GB/T 17592—2011[7]、 GB/T 19942—2005[8]、EN 14362等方法标准[8-10]作为检测依据。

目前芳香胺的定量检测方法主要有高效液相色谱法（ HPLC）[11-14]、气相色谱—质谱联用法（ GC- MS）[15-16]等。在禁用芳香胺的检测中，由于样品基体多样，杂质成分繁多，分析设备的局限性，把杂质、干扰物和同分异构体误报假阳性结果的情况也经常发生，为避免此类问题，必须同时采用两种或以上的色谱方法进行定性确认。对于这些复杂样品，使用高效液相色谱法（HPLC）或气相色谱—质谱联用法（GC-MS）都无法准确地定性定量。近些年出现的液相色谱串联质谱法[17]广泛应用于分析实验室，本试验通过优化高效液相色谱—条件和质谱条件，优化了一套高效液相色谱—串联质谱分析禁用芳香胺及其同分异构体的方法，在16min内完成了芳香胺的快速分离检测。建立了一种灵敏度高、快速、选择性好的纺织品或皮革制品中禁用芳香胺及其同分异构体的检验方法，该方法能有效排除假阳性结果，能够将这些检测的目标物禁用芳香胺，与液相或者气质都无法分开的干扰性物质分开。

1 试验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相串联质谱仪：6490 Tripe Quad LC/MS型，美国安捷伦公司；电子天平：XS105DU METTLER TOLEDO公司；甲醇：色谱纯CNW公司；禁用芳香胺及其同分异构体标准品，德国Dr.E公司。

标准溶液的配制：用甲醇将21种致癌芳香胺分别配制成400mg/L，避光密封后保存在冰箱冷冻箱中；各移取0.2mL的400 mg/L 单标于10 mL容量瓶中，甲醇定容，分别配制成8mg/L的单标和混标，密封避光存于冰箱冷冻箱中。

1.2 高效液相条件

色谱柱：poroshell 120EC C18快速柱（4.6×100mm，2.7μm）；流动相：甲醇（A）和0.025mol/L的乙酸溶液（B）；柱温：30℃；进样量：3?L。洗脱程序如表1。

1.3 质谱条件为

Agilent ESI源（Jet Stream）；正离子模式；毛细管电压3.5kV；雾化器压力20Psi；干燥气温度300℃；干燥气流速12mL/min；鞘气温度350℃；鞘气流量10mL/min；裂解电压380V，定性和定量采用多反应监测（MRM）模式，外标法定量。

1.4 样品处理

以纺织品为例介绍样品前处理。取有代表性样品，剪成约5mm×5mm的小片，混合。从混合样中称取1.0g，精确至0.01g，置于反应器中，加入17mL预热到（70±2）℃的柠檬酸盐缓冲溶液，将反应器密闭，用力振摇，是所有试样浸于液体中，置于已恒温至（70±2）℃的水浴中保温30min，使所有的试样充分润湿。然后，打开反应器，加入3.0mL连二亚硫酸钠溶液，并立即密闭振摇，将反应器再在（70±2）℃水浴中保温30min，取出后2min内冷却到室温。把处理液倒入硅藻土提取柱中，任其吸收15min，用4×20mL的乙醚分四次洗提反应器中的试样，每次需混合乙醚和试样，然后将乙醚洗液滗入提取柱中，控制流速，收集乙醚提取液于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上35℃低真空度下浓缩至近1mL，再用氮气缓慢吹扫至近干后用1mL甲醇混匀静置，用0.22μm微孔滤膜过滤后，供LC/MS/MS测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

芳香胺母离子多数为[M+H]+型阳离子，可通过对所有的离子进行扫描得到，该方法扫描的质荷比范围可从50到比各个芳香胺分子量大100。用自动进样器将8?g/mL的芳香胺标准溶液输入ESI电离源，电离源参数见1.3中的质谱条件。采用质谱直接进样的方式对碰撞能进行优化，使禁用芳香胺及其同分异构体的特征离子强度达到最佳，得到各个芳香胺的MRM质谱分析参数见表2。

当分析目标物为二氨基甲苯，不能确认是含2，4—二氨基甲苯还是含2，6—二氨基甲苯时，使用2.2的仪器分析方法进行分析检测。

2.2 二氨基甲苯同分异构体的分离与检测

色谱柱：Agilent， Edipse Plus C18，RRHD 1.8μm， 2.1×50mm；流动相：流动相A：甲醇；流动相B ：0.1mol/L的乙酸铵溶液，pH=3.6。

以0.2mL/min、25%的流动相A，等度洗脱，10min内能将二氨基甲苯的5种同分异构体全都检测出来。endprint

2.3 色谱条件的优化

由于多反应监测MRM技术能让洗脱液混合物分离，使得所有的离子都能观察到，因此无需要求芳香胺达到基线分离。但是色谱峰的重叠会导致芳香胺在离子化过程中的相互抑制，利用色谱分离可以减少色谱峰的重叠，从而减少芳香胺之间的相互影响，提高特征离子峰的强度，保证定量结果的准确性。本研究分别考察了反相色谱对芳香胺的分离效果，分别优化了流动相组成与梯度洗脱程序、流速等色谱参数，确定了最佳的色谱条件，禁用芳香胺及同分异构体的保留时间数据见表3。

2.4 方法的检测低限和线性范围

检测低限：用0.1mg/L的混合标样进行液质分析。得到的21种禁用芳香胺的信噪比都大于10，因此0.1mg/L这个浓度可以作为此方法定量的检测低限，远低于国家检测方法标准中规定的5mg/kg的最低检测限。

工作曲线：用400mg/L的储备液分别配制成0.1mg/L、0.5mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L一系列的标准工作溶液，在选定的色谱和质谱条件下对液质进行标准工作曲线的测定。各目标物的线性相关系数R2都大于0.99，说明仪器能够满足线性定量要求。

2.5 方法的精密度和实际样比对验证

精密度：采用经测定不含有禁用芳香胺的染色纺织品样品进行方法精密度试验，样品添加5 mg/L和20 mg/L左右两个浓度标准溶液，按本文方法极性前处理，用液质平行测定7次，相对标准偏差（RSD）（n=7）值均小于6%。

实际样品不同仪器检测结果比对：采用本项目开发的方法，对几份样品同时进行GC/MS和HPLC/DAD以及HPLC/MS测定，其结果如表4所示。

从表4可以看出，HPLC/MS的检测值能够很好地对GC/MS和HPLC/DAD的结果进行验证，并且能够很好地鉴别出假阳性物质，以及禁用偶芳香胺的同分异构体，进一步验证GC/MS或者HPLC/DAD的检测结果，提高定性定量检测结果的准确性。

3 结论

通过方法的检测低限和线性范围，方法精密度以及实际样品的不同仪器分析结果比对，验证方法的可行性和优越性。LC—MS/MS具有比单纯GC— MS和HPLC更高的专一性和灵敏度，因LC—MS/MS可以进行两次离子选择，且经过色谱柱再进入质谱仪可进一步分离杂质，改善信噪比，提高灵敏度，进行多组分同时快速定量分析。本试验方法具有操作简单、分析时间短、节省溶剂、准确度好等优点，适用于基质复杂的纺织品和皮革样品，以及含有致癌芳香胺同分异构体的纺织品和皮革样品的分析检测。

参考文献：

[1] ISO/TS 17234 Determination of certain azo colorants in dyed leathers[S].

[2]GB 18401 国家纺织产品基本安全技术规范[S].

[3]LFGB §64 BVL B 82.02 – 2. Testing of commodity articles detection of the use of certain azo dyes from textile commodity articles[S].

[4] LFGB §64 BVL B 82.02 – 3. Testing of certain azo colorants in dyed leathers[S].

[5] LFGB §64 BVL B 82.02 – 4. Testing of commodity articles detection of the use of certain azo dyes from polyester fibres[S].

[6] DIN 53316 Testing of leather-determination of certain azo dyes in leather[S].

[7] GB/T 17592纺织品禁用偶氮染料的测定[S].

[8] GB/T 19942 皮革和毛皮禁用偶氮染料的测定[S].

[9] EN14362-1 Direct test on colored textiles-detection of the use of certain azo colorants that are accessible to reducing agents without extraction[S].

[10] EN14362-2 Extraction test on colored textiles-detection of the use of certain azo colorants in fibres with extractable dyes[S].

[11]吴转璋，丁健桦，赖劲虎，陈焕文. 纺织品中偶氮染料还原液内芳香胺的电喷雾电离质谱分析[J].岩矿测试，2008，27（ 4） ： 250-254.

[12] Jo-Shu Chang，Chia-Yu Lin. Decolorization kinetics of a recombinant Escherichia coli strain harboring azo-dye-decolorizing determinants from Rhodococcus sp.[J]. Biotechnology Letters . 2001 （8）：56-63.

[13]Emilie Perraudin，Hélène Budzinski，Eric Villenave. Analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons adsorbed on particles of atmospheric interest using pressurised fluid extraction[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry . 2005 （1）：121-131.

[14] 丁健桦，何海霞，林海禄，等. 离子液体-液相微萃取——高效液相色谱法测定纺织品中芳香胺[J]. 分析化学，2008，36（12） ： 1662.

[15] KUROPKA P，GRYTA J，MAYER W，ALLEN J Forbidden azo dyes.Detection of certain azo dyes based on 4-aminoazohetmene [J].GIT Labor—Fachzeitschrift，2005，49（7）：597-600.

[16] 张焱，李英，张裕平. 应用GC-MS法分离测定棉织物上的禁用芳胺[J].光谱实验室，2006，23（ 5） ： 952.

[17]唐川江，聂锦，王晓宁，等.高效液相色谱—串联质谱法测定纺织品中的致癌芳香胺[J].分析实验室，2011，30（9）：75-78.

（作者单位：广州纤维产品检测研究院）endprint