SSR分子标记技术在甘蓝型油菜杂交种陕油16纯度鉴定中的应用

卢 虹， 徐爱遐

（西北农林科技大学农学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室， 陕西 杨凌712100）

油菜属于十字花科芸薹属，是世界四大油料作物（大豆、油菜、花生、向日葵）之一。中国是重要的油菜生产国，2013—2014年度中国的油菜籽产量占世界总产量的20.6%。2012—2013年度中国油料播种面积为1 402.3万hm2，油菜籽播种面积为753.1万hm2，占油料播种面积的53.7%。2012—2013年度较往年油菜播种面积、总产增加，但是单产降低［1］，杂种优势的利用是一种有效的提高油菜产量的重要途径。

随着油菜杂种优势的利用，市场上的杂交油菜推广面积占油菜生产总面积的60%［2］。杂种利用的主要途径有：细胞质雄性不育（CMS）、细胞核雄性不育（GMS）、化学诱导雄性不育（CHA）和自交不亲和性（SI）等［3］，但目前应用于生产的细胞质雄性不育主要是高温不育型，在低温条件下容易产生微粉，造成自交结实从而影响杂交种的纯度［4］。因此，对杂交种的纯度研究显得尤为重要。

目前，农作物杂交种纯度的鉴定方法主要有三大类：形态学鉴定、生化标记鉴定和DNA水平鉴定。形态学鉴定周期长，易受环境影响，相似形态特征的鉴定困难，鉴定者的经验制约设鉴定的准确性，而且花费高；生化标记鉴定不稳定受环境影响较大，具有严格的组织和时间表达特异性［5－6］。DNA水平鉴定有DNA分子标记技术和基因组DNA的光谱分析（Fourier transform infrared spectroscopy）［7］，DNA 分子标 记技术可以有效的避免上述问题，具有简便、快速、准确的特点。DNA分子标记技术主要包括RAPD、SRAP、SSR、ISSR、EST－SSR、INDEL、AFLP 等［8－12］。其中，SSR分子标记技术广泛应用于油菜［13］、大豆［14］、向日葵［15］、棉花［16］、水稻［17－8］、玉米［19］等的杂交种纯度鉴定。

本试验利用SSR标记技术对甘蓝型油菜陕油16杂交种纯度进行研究，以期找到可以鉴定陕油16杂交种纯度的SSR标记。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘蓝型油菜杂交种陕油16及其双亲9A（♀）和530C（♂）均由西北农林科技大学油菜中心品种资源课题组提供。陕油16大田制种种子样本由杨凌金诺公司和杨凌高科公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成

80对引物来源于白菜型油菜基因组已公布信息，下载网址 http：／／brassicadb.org／brad／geneticMarker.php？chr＝ALL。所有引物均有上海生工生物技术服务有限公司合成。

1.2.2 DNA的提取与检测

杂交种陕油16及其亲本各取100粒，大田制种种子各取400粒，分别均匀放入铺有2层吸水纸的培养皿中，早晚各浇水1次，室温下发芽5～7d。取幼芽上半部分放入研钵中，随机选取实验材料父本、F1、母本标准样品10个单株的幼嫩子叶分别混合磨样，提取DNA用于标记筛选。陕油16大田制种材料分别取188株并编号，进行单株DNA提取，用于纯度鉴定。基因组DNA提取采用CTAB法进行［20］。

1.2.3 杂交种及其亲本的SSR分析

1）PCR扩增。PCR循环参数94℃预变性3 min，94℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸45s，此后每个循环退火温度降低0.5℃，共计9个循环；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸45s，29个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

表1 PCR反应体系

2）电泳检测。样品从PCR中取出来后加入等体积的Loading buffer，放入水浴中变性5min，然后放入冰水混合物中冷却；然后在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳（U＝2 000VI＝200AP＝85W）45min左右；电泳完成后，用10%醋酸固定20min后，蒸馏水漂洗2遍，每次10min；然后用硝酸银染色、碳酸钠显影，再用10%醋酸固定，经漂洗后自然风干，拍照保存。

1.3 种子纯度的鉴定

1.3.1 SSR分子标记鉴定

用80对SSR引物在构建的陕油16及其双亲的基因池中进行筛选，用筛选到的具有差异的SSR引物鉴定陕油16大田制种材料的纯度。杂交种纯度（%）＝具有双亲特征条带的样本数／检测的样本总数×100%。

1.3.2 田间植株鉴定

陕油16种植于西北农林科技大学油菜实验基地，每个品种设2个小区，进行常规田间管理，不间苗，在盛花期统计总株数以及不育株数。

鉴定方法为：当天开的花中，如果有花朵的花药高于柱头、正常散粉且发育正常则记为可育株，花朵较小、花药等于或低于柱头且雄蕊退化不能散粉的单株记为不育株，其中未开花的单株不计数。

2 结果与分析

2.1 特征型引物的筛选

用80对SSR引物在陕油16杂交种及其亲本中进行筛选和群体验证后，确定有3对引物SSR 313、SSR 354、SSR 359在陕油16杂交种及其亲本中存在多态性，扩增带型清晰，容易分辨，且在陕油16及其双亲中表现共显性，见图1，引物序列见表2。

2.2 SSR标记用于陕油16杂交种种子纯度鉴定

试验中共检测了188个陕油16杂交种单株（如图2～图4箭头所示），与P1条带相同的记为母本（不育系），与P2条带相同的记为父本（恢复系），与F1条带相同的记为杂交种；图2，图3，图4分别是SSR 313、SSR 354、SSR 359用于陕油16大田制种种子纯度鉴定图（部分）。

表2 SSR引物序列

图1 SSR引物对陕油16及其亲本的扩增结果

图2 SSR 313对陕油16部分单株及其亲本的扩增结果

图3 SSR 354对陕油16部分单株及其亲本的扩增结果

图4 SSR 359对陕油16部分单株及其亲本的扩增结果

统计2品种杂交种种子中不育系（母本）比率、恢复系（父本）比率和杂交种纯度鉴定结果见表3。从表3可以看出，SSR标记鉴定结果中不育株比率均大于恢复系比率。

表3 陕油16杂交种种子纯度鉴定结果

2.3 田间植株鉴定

于油菜盛花期（4月1日）在田间对陕油16鉴定圃材料进行全区逐株观察鉴定，鉴别育性。田间种植鉴定结果显示，陕油16品种的平均纯度为85.61%，结果见表4。

对陕油16的SSR鉴定结果与田间鉴定结果进行了比较分析，结果显示，田间鉴定的平均纯度高于SSR鉴定结果3.71%。

表4 陕油16的田间鉴定结果

3 讨 论

首先，本研究筛选的SSR引物在陕油16的F1代杂交种扩增结果均具有亲本的两条带，说明SSR标记有稳定的共显性，可以用来鉴定甘蓝型油菜的杂交种纯度。

其次，本研究发现，分子标记鉴定结果中，不育株率较父本株率高，说明母本因微粉导致的自交是杂交种种子纯度降低的重要原因。因此，在制种过程中要特别注意母本的育性，可采用化学杀雄的方法尽量避免由于微粉造成的杂交种纯度降低。

此外，本研究中SSR标记纯度鉴定结果均低于田间鉴定结果，与王同华等［21］的研究结果一致，出现这种现象的可能原因是田间鉴定主要通过形态学特征进行判断，由于材料间亲缘关系较近，很难做出准确的鉴定，而SSR分子标记技术可以准确识别非杂交单株，如由于母本因微粉导致的自交、花粉污染、机械混杂等原因造成的混杂，因此，SSR标记技术得到的纯度鉴定结果比种植鉴定的结果更为可靠、准确。

［1］王汉中，殷艳.我国油料产业形势分析与发展对策建议［J］.中国油料作物学报，2014，36（4）：414－421.

［2］傅廷栋.油菜的品种改良［J］.作物研究，2007（3）：159－162.

［3］傅廷栋.杂交油菜的育种与应用［M］.武汉：湖北科学技术出版社，1995：124－129.

［4］苏英.甘蓝型油菜品种的细胞质育性类型初探［J］.陕西农业科学，2012（6）：181－182，246.

［5］梅眉，陆璐.DNA分子标记技术在农作物种子质量检验中的应用［J］.分子植物育种，2005，3（1）：129－134.

［6］刘子记，曹振木，杨衍.应用分子标记技术检测作物杂交种纯度研究进展［J］.种子，2013，32（6）：48－52.

［7］Song S Y，Eun Y J，Myung S A，et al.Fourier transform infrared（FT－IR）spectroscopy of genomic DNA to discriminate F1progenies from their paternal lineage of Chinese cabbage（Brassica rapasubsp.pekinensis）［J］.Molecular Breeding，2013，33（2）：453－464.

［8］Huang C Q，Liu G D.Bai C J，et al.Application of SRAP markers in the identification of Stylosanthes guianensis hybrids［J］.Mol Biol Rep，2014，41（9）：5 923－5 929.

［9］Ye S，Wang Y，Huang D Q，et al.Genetic purity testing of F1hybrid seed with molecular markers in cabbage（Brassica oleracea var.capitata）［J］.Scientia Horticulturae，2013，155：92－96.

［10］Naresh V，Yamini K N，Rajendrakumar P，et al.EST－SSR marker－based assay for the genetic purity assessment of safflower hybrids［J］.Euphytica，2009，170（3）：347－353.

［11］王玲平，戴丹丽，吴晓花，等.AFLP分子标记技术在浙蒲2号种子纯度快速鉴定中的应用［J］.浙江农业学报，2008，20（2）：84－87.

［12］葛敏，蒋璐，张晓林，等.利用Insertion／Deletion（InDel）分子标记检测玉米互交种混杂的原理及应用［J］.分子植物育种，2013，32（1）：37－47.

［13］Chen F，Zhang J F，Chen S，et al.A Method for Rapid Identification of Ningza 11［J］.Molecular Biology and Tissue Culture，2014，15（1）：9－12.

［14］Zhang C B，Peng B，Zhang W L，et al.Application of SSR Markers for Purity Testing of Commercial Hybrid Soybean（Glycine max L.）［J］.Journal of Agriculture Science and Technology，2014，16：1 389－1 396.

［15］Pallavi H M，Rame G，Shadashari Y G，et al.Identification of SSR markers for hybridity and seed genetic purity testing in sunflower （Helianthus annuus L.）［J］.Helia，2011，34（54）：59－66.

［16］Dongre A，Vilas P.Identification of Cotton Hybrid through the Combination of PCR Based RAPD，ISSR and Microsatellite Markers［J］.J.Plant Biochemistry ＆ Biotechnology，2005，14：53－55.

［17］Sundaram R M，Naveenkumar B，Biradar S K，et al.Identification of informative SSR markers capable of distinguishing hybrid rice parental lines and their utilization in seed purity assessment［J］.Euphytica，2008，163（2）：215－224.

［18］Hashemi S H，Sayyed A M M，Ghorban A N，et al.Identification of rice hybrids using microsatellite and RAPD makers［J］.African Journal of Biotechnology，2009，8（10）：2 094－2 101.

［19］李晓辉，李新海，李文华，等.SSR标记技术在玉米杂交种种子纯度测定中的应用［J］.作物学报，2003，29（1）：63－68.

［20］Doyle J J，Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］.Phytochemical Bulletin，1987，19：11－15.

［21］王同华，陈卫红，李莓，等.基于SSR标记技术的油菜杂交品种沣油958的种子纯度鉴定［J］.现代农业科技，2014，18：20，25.