黄芩种子质量检验方法研究

2016-01-17李云静张建逵何婉婉康廷国

种子 2016年6期

李云静，张建逵，何婉婉，康廷国，王冰

（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

中药黄芩为唇形科植物黄芩（Scutallaria baicalensis Georgi）的干燥根。味苦性寒。具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎之功效［1］。目前市售黄芩的主流商品是栽培品。但栽培黄芩的种子质量参差不齐，种子质量直接影响到种苗的生长以及药材的品质与产量。因此，需要通过科学有效的方法对市场流通的黄芩种子进行质量检验。本实验对黄芩种子质量检验方法进行了初步研究，以期为今后制定黄芩种子质量检验规程以及质量分级标准提供参考。

1 材料

黄芩种子分别采自山东省沂水县，河北省承德市，陕西省澄城县，山西省长治县，安徽省亳州市和甘肃省陇西县等6地。经辽宁中医药大学王冰教授鉴定，均为唇形科植物黄芩（Scutallaria baicalensis Georgi）的种子。

2 方法

2.1 扦样

参照《农作物种子检验规程扦样》（GB／T 3543.2）的标准执行［2］。根据黄芩种子市场流通情况和单次可能的交易量，净度分析不少于2 500粒种子，送检样品量应不少于净度分析10倍量原则，确定净度分析及送检的最小样品量。

2.2 净度分析

依照《农作物种子检验规程净度分析》（GB／T 3543.3）执行［2］。将扦样得到的种子，分别称取5g，置于洁净的玻璃板上，在不损伤种子的基础上，用镊子将净种子与杂质及其他种子区分开，并分别称重，重复3次，计算净种子率。

净种子率（%）＝净种子质量／（杂质质量＋其他种子质量）×100%。

2.3 真实性鉴定

观察种子外观形态表面特征及颜色，每个产地随机数取100粒净种子，4次重复，用游标卡尺对种子的长度、宽度与厚度进行逐粒测量，并对测量结果进行记录。

2.4 重量测定［2］

分别用百粒法、五百粒法和千粒法测定每份种子样品的重量。分别计算变异系数。

2.5 水分测定

参照《农作物种子检验规程水分测定》（GB／T 3543.6）执行［10］。分别采用高温烘干法和低恒温烘干法测定每个产地种子样品的含水量。

1）低恒温烘干法：分别在（105±2）℃低恒温条件下设置5，10，15，20h计算种子水分损失量。

2）高温烘干法：分别在（133±2）℃高温条件下，设置1，2，3，4，5h计算种子水分损失量。

以上测定每产地3次重复，每重复（5±0.001）g。

2.6 生活力测定［3］

2.6.1 氯化三苯基四氮唑法（TTC法）

将各产地的黄芩种子编号，每产地种子随机分为2组，一组用沸水煮15min至失活，作为空白对照，另一组用蒸馏水在室温下浸泡5h，使种皮软化种子吸胀。每批种子均用浓度为0.4%，0.7%，1%的氯化三苯基四氮唑溶液染色，染色温度为25，30，35，40℃共4个水平，染色时间分别为2，4，6h。染色结束后根据种胚的着色部位及着色程度来鉴定种子的生活力，每个处理设3次重复，每重复100粒。并计算有生活力种子的百分率。用均匀设计法来优化种子的最优染色条件。

2.6.2 红墨水染色法

将各产地的黄芩种子编号，每产地种子随机分为2组，一组用沸水煮15min至失活，作为空白对照（死种子），另一组直接染色。用靛红染色剂配制成浓度为5%的靛红染色液，在30℃恒温条件下染色，染色时间分别为2，3h。染色完毕后，用自来水冲洗4～5次，洗去染色液，根据种胚着色程度及空白对照来鉴定种子的生活力，每个处理3次重复，每重复100粒。计算有生活力种子的百分率。

2.6.3 溴麝香草酚蓝法（BTB法）

将各产地的黄芩种子编号，每产地种子随机分为2组，一组用沸水煮15min至失活，作为空白对照，另一组用蒸馏水在室温下浸泡5h使种子吸胀。然后分别把已经吸胀的黄芩种子整齐的接种于备好的0.05%，0.1%，0.2%的 BTB琼脂凝胶中，在30℃恒温条件下培养2h后，观察种子周围出现黄色晕圈的情况，若出现晕圈则表明种子有活力。每个产地各浓度水平设3次重复，每重复100粒。计算有生活力种子的百分率。

2.7 发芽率测定［2－3］

2.7.1 发芽前处理方法的选择

种子先用0.1%的次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，再用蒸馏水冲洗4～5遍，之后进行发芽前处理。1）种子未用蒸馏水常温浸泡吸胀，直接进行发芽试验；2）种子用蒸馏水常温浸泡过夜，吸胀后进行发芽试验。以上种子以纱布垫双层滤纸为发芽床，恒温25℃无光照培养箱中进行发芽试验，每处理3次重复，每重复100粒种子。

2.7.2 发芽床的选择

各产地种子经蒸馏水常温浸泡过夜吸胀后，选取纸上，纸间，沙上，沙间，纱布，纱布垫纸6种发芽床试验。将各个产地的种子分别置于6种不同发芽床，在25℃恒温，无光照条件的培养箱中发芽。每处理3次重复，每重复100粒种子并计算发芽率。

2.7.3 发芽温度的选择

各产地种子经蒸馏水常温浸泡过夜吸胀后，以纱布垫纸为发芽床，分别置于15，25，35℃恒温无光照恒温培养箱中培养，每处理3次重复，每重复100粒种子并计算发芽率。

2.7.4 发芽首次和末次计数时间的确定

记录种子初次和末次发芽时间，以胚根突出种皮长度达到种子长度一半时的天数作为初次计数时间；以种子发芽数达到最高，以后再无发芽种子出现时的天数作为末次计数时间。

2.7.5 发芽率和发芽势的测定

通常种子着床后3～5d时种子发芽速度最大，因此在种子培养5d时计算发芽势。

发芽率（%）＝发芽种子总数／供试种子数×100%；

发芽势（%）＝发芽高峰期发芽的种子数／供试种子数×100%。

2.8 种子健康检验

2.8.1 带菌率检验

各产地种子随机抽取10粒，参照文献［2］和文献［3］的方法操作。

2.8.2 害虫检验

各产地种子随机抽取50粒，参照文献［4］的方法操作。

3 结果与分析

3.1 扦样

参照《农作物种子检验规程》（GB／T 3543.2）的标准执行，种子批的最大重量为10 000kg，送检样品最少为50g，净度分析试样最少为5g（不少于2 500粒）［2］。

3.2 净度分析

各产地的黄芩种子净度测定结果见表1。种子净度均能达到90%以上。使用此方法做净度分析，各组试样增失差距均没有偏离原始质量的5%。因此，本方法科学可行。

3.3 真实性鉴定

种子真实性鉴定结果如下：小坚果，长圆形至卵圆形，扁平，腹面近基部具果脐，长0.85～2.35mm，宽0.38～1.75mm，厚0.19～1.36mm，黑褐色或浅黑褐色，种皮表面具不规则棱，千粒重一般为1.469～1.910g。

表1 种子的净度分析

3.4 重量测定

采用3种不同方法对黄芩种子重量分析比较的结果见表2。百粒法的变异系数大于4.0%；通过方差分析，五百粒法及千粒法2种方法测定6份种子试样的重量，各处理间无显著性差异（p＝0.201＞0.05），并且数据重复间变异系数均小于4.0%，测定值均有效。因此，五百粒法和千粒法均可用于黄芩种子的重量测定，鉴于前者所需的种子量较少，故选用五百粒法。

表2 种子不同重量测定方法比较

3.5 水分测定

采用2种方法对各产地黄芩种子试样进行水分测定，结果见表3。从表3可看出，黄芩种子在高温下烘干4h后，失水量基本保持稳定。低恒温烘干后5～15 h内失水量差异较大，20h后重量基本稳定。对高温烘干4h和低温烘干15h进行差异显著性检验，2种烘干方法间测定值无显著性差异（p＞0.05）。鉴于低恒温烘干法耗时较长，故选择高温烘干4h为宜。

3.6 生活力测定

3.6.1 氯化三苯基四氮唑法（TTC法）

影响染色效果的因素主要有染色温度（A），染色时间（B），TTC浓度（C），采用均匀设计的方法，以种胚的染色率为评价指标，参照回归方程选择最佳染色条件。回归方程为：Y ＝－84.911＋2.651×A＋5.479×B＋23.611×C，R＝0.954。因此优化的条件为：TTC浓度1%，染色温度40℃，染色时间为6h。

3.6.2 红墨水染色法

从表4可看出。对不同培养时间的具生活力种子平均比率进行差异性检验，结果无显著性差异（p＞0.05），故红墨水染色法的条件为30℃恒温条件下染色2h。

3.6.3 溴麝香草酚蓝法（BTB法）

从表5可看出，其中浓度为0.05%，0.1%的BTB琼脂凝胶中均有种子周围出现黄色晕圈，但浓度为0.2%BTB琼脂凝胶中的种子周围并未出现黄色晕圈，无法统计具生活力种子比率。其原因可能是由于黄芩种子呼吸作用释放出的CO2浓度较低，未达到显色的程度。对0.05%和0.1%2个浓度的具生活力种子比率进行差异性检验，结果并无显著性差异（p＞0.05），考虑到节省实验材料，故选择浓度为0.05%，的BTB琼脂凝胶进行显色培养。

3.7 发芽试验

3.7.1 发芽前处理方法

从表6可看出，吸胀处理和未吸胀处理种子发芽率有极显著性差异（p＜0.01）。因此应将种子用蒸馏水于室温下浸泡过夜，使种子吸胀后置于发芽床上进行发芽培养。

3.7.2 发芽床与发芽温度的选择

不同产地的黄芩种子均已经过1%的次氯酸钠溶液消毒10min，并浸泡过夜使之吸胀，不同发芽床、不同发芽温度下的发芽率和发芽势见表7，由表7可见，种子在纱布垫纸的发芽床上的发芽率和发芽势均为最高，25℃为最佳培养温度。故种子最佳发芽条件为25℃时纱布垫纸培养床。

表3 不同烘干方法种子失水量的变化

表4 红墨水法测定种子的生活力

表5 BTB法测定种子的生活力

表6 不同前处理方法的种子发芽率

3.7.3 发芽天数的确定

黄芩种子经浸泡吸胀，置床后第2天便出现发芽现象，第5天后发芽速度明显下降，逐渐缓慢，第8天几乎停止发芽，见图1。所以第2天为初次发芽记录时间，第7天为末次发芽记录时间。

图1 种子发芽率随发芽天数变化趋势

3.7.4 种子生活力与种子发芽率相关性分析

选取最适发芽条件及3种生活力测定法的最优条件对不同产地的种子进行培养，对其发芽率与生活力进行测定，结果如表8所示。

将3种生活力测定方法的结果与相应的发芽率结果进行相关性分析，其中BTB法和红墨水法测定结果与发芽率测定结果相关性均不显著（p＞0.05）。TTC法测定结果与发芽率测定结果具有极显著相关性（p＜0.01），相关系数为r＝0.943。故选择 TTC法为黄芩种子生活力测定方法。

3.8 种子健康检验

对6批种子进行带菌率及害虫检验，结果见表9。

3.9 黄芩种子质量检验方法的确定

根据以上实验结果，初步建立了适合黄芩种子的质量检验方法，见表10。

表7 不同发芽床、不同发芽温度下的发芽率和发芽势

表8 种子生活力与发芽率

表9 带菌率及害虫检出率

表10 黄芩种子质量检验方法

4 讨论

4.1 实验分别使用了TTC法，BTB法及红墨水染色法对6份不同产地的黄芩种子进行了生活力检测，种子均能检测出有较高的生活力，但考虑到生活力与种子实际发芽率间的关系，只有将生活力测定结果与种子的实际发芽率进行相关性分析之后，才可根据相关性的大小来判定哪种生活力检测方法最适合。本实验所采用的生活力检测方法与国家标准的相同，亦可说明TTC法检测的科学合理性。

4.2 本实验的种子质量检验方法与地方标准［5－6］相比，增加了种子健康度的检验，可为今后种子分级标准的制定提供更全面的参考。

4.3 在重量，含水量，生活力，发芽率及健康度等指标的检测中均采用了不同的方法，而测定方法的不同，测出的结果也不同。所以若要使种子质量检验结果准确、一致，则必须要制定一个统一、科学有效的种子质量检验方法。

4.4 开展中药材种子质量研究，制定中药材种子质量级标准，是推进中药材规范化栽培的一项重要任务［7］。近5年来，已有白花蛇舌草［8］、川白芷［9］、苦参［10］、王不留行［11］、水飞蓟［12］牛蒡［13］、云木香［14］等种子的质量检验方法研究报道。黄芩种子目前还没有国家质量标准，本研究选参照《农作物种子检验规程》，从扦样、净度分析、真实性鉴定，重量测定、发芽试验、水分测定、生活力测定、健康度测定8个方面对黄芩种子质量检验方法进行了研究，初步确定了黄芩种子的质量检验方法，为制定黄芩种子检验规程及分级标准奠定了基础，对促进黄芩规范化种植具有推动作用。

［1］国家药典委员会，中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2015：301－302.

［2］国家技术监督局，农作物种子检验规程（GB／T 3543－1995）［S］.1995.

［3］孙荣进，杜婷，杨光义，等.蔓荆子种子生活力的测定及其与发芽率的相关性研究［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（17）：130－133.

［4］周陛勋.林木种子检验［M］.北京：中国标准出版社，1986：171－172.

［5］安徽省质量技术监督局.安徽省地方标准：黄芩种子（DB 34／554－2005）［S］.2005.

［6］河北省质量技术监督局.河北省地方标准：中药材种子质量标准第2部分：黄芩（DB 13／T 1083.2－2009）［S］.2009.

［7］任德全，周荣汉.中药材生产质量管理规范（GAP）实施指南［M］.北京：中国农业出版社，2003：26－26.

［8］卢魏魏，朱再标，郭巧生，等.白花蛇舌草种子质量检验方法研究［J］.中国中药杂志，2012，37（10）：1 366－1 371.

［9］杨枝中，蒋运斌，穆向荣，等.川白芷种子质量检验方法研究［J］.种子，2013，32（12）：119－122.

［10］李安平，吴尚英，关扎根，等.苦参种子质量检验方法的研究［J］.中国农学通报，2013，29（16）：175－180.

［11］高钦，杨太新，刘晓清，等.王不留行种子质量检验方法的研究［J］.种子，2014，33（10）：116－120.

［12］张爱霞，陈叶，祁林强，等.水飞蓟种子质量检验方法研究［J］.中草药，2015，46（4）：580－583.