急性缺血性脑卒中中循环miRNA的相关研究进展

张家康　王枭雄　陈鑫　杨光　张大明　钟晨　赵世光



·综述·

急性缺血性脑卒中中循环miRNA的相关研究进展

张家康王枭雄陈鑫杨光张大明钟晨赵世光

150001哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科

【DOI】10.3969/j.issn.1007-0478.2016.03.021

脑血管病是人类三大致死性疾病之一，已成为影响人类身体健康的一大难题。从1985～1991年统计的年发病率为116～219/100 000，其中缺血性脑卒中占脑卒中的75%。缺血性脑卒中是指由于脑的供血动脉(颈动脉和椎动脉)狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑功能障碍的总称,分为动脉血栓性脑梗死21.5%、栓塞性脑梗死7.5%、腔隙性脑梗死40.6%及其他原因引起的脑梗死或TIA[1]。可出现不同的功能缺失表现，使患者的生活质量严重下降。即使经过系统的治疗、康复锻炼后，患者的致残率仍能达到40%，给人民的生活及国家经济发展带来不小的经济负担。

1miRNA

miRNA是由21～22个左右的核苷酸组成的内源性的RNA，在核内miRNA基因由RNA-polII催化转录形成pri-miRNA，在Drosha酶的作用下去掉帽子结构及多聚腺苷酸尾形成前体miRNA，经过erportin5的运输，Dicer酶的剪切、沉默复合体的作用最终形成成熟的miRNA[2]。Lee等人[3]在1993年最先从线虫幼虫研究中发现lin-4的存在，能够调节线虫幼虫成熟的时机。7年后Reinhart等人[4]又在线虫中发现miRNA家族let-7。此后关于miRNA的研究越来越多，发现的miRNA数量也在不断增加。从MIRBASE网站中搜索。可以看到miRNA广泛存在于动物、植物、真菌、病毒中，而且单单在人类身体中发现的miRNA前体就有1881种，成熟体有2588种。miRNA功能涉及发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等[2]，由此为癌症、代谢性疾病等领域的治疗提供指导。这里本研究通过总结miRNA在缺血性脑卒中中作为循环生物学标记的研究，希望能对今后的缺血性脑卒中研究及临床治疗方法提供帮助。

2008年Lawrie第1次对血清中存在miRNA进行了描述，对弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血清中与肿瘤相关的microRNA进行研究发现血清中MIRN155 (miR-155)， MIRN210 (miR-210) and MIRN21 (miR-21)水平较对照组升高，且MIRN21与早期复发有关[5]，由此开启了循环中microRNA作为各种疾病生物学标记的研究。并且其样本在低于-80 ℃的情况下也不会被破坏，为相关研究的血液样本保存提供了有力的支持[6]。为miRNA作为血液学诊断标记打下基础。

2缺血性脑卒中循环miRNA研究

目前miRNA的分泌机制还不完全清楚，有研究表明miRNA在血清中的存在形式主要有脂质小泡和游离两种形式，在细胞与细胞间起信息连接的作用。脂质小泡又包括外质体(大小约30～100 nm)、微泡(100～1 000 nm)和凋亡小体，但外质体与微泡通过现有的方法是很难准确区分开的[10,11]。外质体最早由Trams等人[12]在1981年的研究中定义，证明其来源于细胞膜，Valadi等人[13]证明释放的外质体含有细胞内mRNA和miRNA，把这些物质转运到靶向细胞，包含在外质体中的mRNA和microRNA统称为esRNA。有研究称miRNA的分泌是由神经酰胺(一种生物活性硝质类)数量的增加引起的，而神经酰胺的合成与中性神经硝磷脂酶有关[14]。

miRNA在循环中存在于脂质小泡中，所以不会被RNA酶破坏。在血清及血浆中游离miRNA也能稳定存在。Arroyo等人[15]应用差速离心法和尺寸排阻色谱法来描述循环miRNA的特性，发现绝大多数miRNA与蛋白复合物结合，而不是囊泡。miRNA也对蛋白酶很敏感，说明蛋白复合物能保护miRNA不受RNA酶损害，进而发现Argonaute2(一种调节miRNA沉默的关键蛋白)复合体保护循环与膜泡无关的miRNA免受RNA酶的破坏。只有少数的特殊miRNA与囊泡有关。

在神经细胞中miR-124表达最为丰富，具有神经元特异性，在星形胶质细胞中不表达，降低miR-124可能降低神经退行性变疾病中神经元的比例，限制增殖促进分化[7]。

在Weng等人的一项研究中发现miR-124只在中枢神经系统中表达，在对大鼠MCAO模型血浆中的miR-124进行监测后发现，血浆中的miR-124在6 h后开始升高，且能维持48 h，提示其可能作为脑缺血的生物学标记[8]。

研究表明miR-125b-2p促进胶质瘤细胞生长、成熟、抗凋亡[9]。主动脉的内皮细胞在暴露于氧化甘油磷脂中后miR-27a*/miR-27a-5p的表达水平上升[10]。在神经细胞凋亡模型中miR-422a的表达水平在第12 h下降，并且 miR-422a与bcl-w呈负相关[11]。Sugunavathi epramaniam等人[12]通过FDR错误控制法，变化倍数等方法从314个miRNA中筛选出了105个与脑卒中有关的miRNA，其中有58个下调、47个上调，而与急性缺血性脑卒中有关的有26个miRNA。随后应用分级层聚统计，TaqMan低密度芯片 (TLDA)、ROC曲线分析等方法选出miR-125b-2*,-27a*,-422a,-488 和 -627，在人的脑缺血急性期(1-7d)明显高于恢复期，且在大鼠模型中6 h都会增高，在急性缺血性脑卒中具有诊断价值。

miR-106b-5p/miR-106b在胶质瘤中高表达,促进胶质瘤细胞生长，抑制凋亡[13]，在内皮细胞介导的血管生成中抑制内皮细胞产生[14]， 在下肢动脉缺血的小鼠中敲除miR-106b后血管生成障碍[15]。 hsa-miR-320能够抑制大鼠心脏内皮细胞迁移及血管生成[16]，在心肌缺血再灌注损伤中表达明显降低，敲除-320后通过增加Hsp20减少心脏缺血再灌注所诱导的心肌损伤[17],在神经退行性变过程中miR-320水平升高[18]。敲除miR-30-5p后通过上调SEPT7抑制胶质瘤细胞，促进凋亡[19]。Wang[6]对急性脑缺血性脑卒中的样本进行统计分析筛选后发现,13个miRNA存在上调，而4个则为下调(hsa-miR-30d-5P，hsa-miR-320e,hsa-miR-320d，hsa-miR-26b-5p文字中显示，图中显示为miR-720)，然后根据生物指标可能在脑卒中发生后的变化是渐进性的这一点出发，找出了4个可以有助于临床诊断的miRNA，其中miR-106b-5p和miR-4306上调，而miR-320e和320d下调。

miR-30a下调能通过提高bclin-1引起的自噬，缺血性对脑损伤起保护作用[20]。miR-126抑制后有助于血管内皮细胞增殖、迁移及血管生成[21]促进神经突生芽，但抑制后对抗STS 和 Aβ1-42的毒性起神经保护作用[22]let-7b通过作用于核受体TLX和cyclin1来促进神经干细胞增殖及分化[23]。Guangwen Long等人[24]根据以往对AMI的研究及缺血性脑卒中与其具有同样的缺血特点，选择对miR-30a,miR-126 和let-7b进行研究，通过对197个缺血性脑卒中患者在不同时间的血液样本收集，并与50名健康患者进行对照，用qRT-PCR分析血样miRNA水平，发现这3种miRNA也可以作为诊断缺血性脑卒中的循环生物标记。

miRNA-223通过GluR2和谷氨酸受体的NR2B亚基起到中枢神经保护作用[25]。Wang收集急性缺血性脑卒中患者第72 h的血样，并用ELISA检测导致miRNA-223下调的相关因子，并通过分析miRNA-223与NIHSS评分，TOAST亚型和脑梗死体积之间的关系。对12只CD-1鼠的大脑中动脉进行缝合阻断24 h后收集血样进行real-time PCR检测显示，miR-223在急性缺血性脑卒中不论在血液还是脑组织中都会升高，但在体内实验并没有发现miR-223与IGF-1有关，提示miR-223增高可能通过其他途径参与脑卒中早期的炎症反应[26]。

3缺血性脑卒中循环miRNA研究的局限性

由于miRNA在不同的细胞作用的机制不尽相同，是上调或下调所反映出的细胞特异性就值得关注，以上实验得出的循环生物标记组合是否也会反映其他疾病的发生或是特定的病理过程，还未有相关实验加以说明。如前文所述，研究中涉及的miRNA在神经及血管等领域起到的作用，研究人员已经做了一定的实验，但循环miRNA做为脑卒中生物学标记的研究相对有限，而在其他疾病或组织中涉及相关miRNA的研究，例如循环miR-223增高与C反应蛋白的水平有关，与早期类风湿性关节炎有关[27]，说明miRNA可以在不同的组织中起作用，而把单一的miRNA作为一种疾病循环生物标记是缺乏特异性的。

缺血性脑卒中的CT阳性表现要到24～48 h后，MRI表现阳性是在缺血4 h后，有研究表明静脉溶栓6 h内有效，而能够在发病3h内进行静脉rtPA溶栓治疗，在降低死亡或生活依赖风险方面具有明确益处，其功能独立的机率提高30%[28]。由此可以看出，急性缺血性脑卒中的治疗时间点对预后非常重要，已治疗越及时，则预后越好。在上述研究中都未能将诊断的时间提升到3 h内，Sugunavathi Sepramaniam等人证明大鼠的循环miRNA生物学标记有意义的时间是在6 h，而人的则是在一周内的变化数据；同样wang等人的实验在采集患者血样时，将0～3 h，3～6 h，6～12 h，12～24 h个采集血样，但遗憾的是没有给出这些时间段筛选出的循环miRNAs的相应变化曲线。Guangwen Long等人将时间点设在72 h，也未能满足快速诊断的条件。以后的相关研究应更多集中在缺血性脑卒中早期特别是3 h以内，循环miRNA变化及其诊断意义。

4结束语

本研究希望有一种简单、便携、快捷、成本低廉的检测方法能满足对急性缺血性脑卒中的治疗要求。从以上几点出发，循环生物学标记是一项前景广阔的研究方向。通过进一步的实验研究，找到能将诊断急性缺血性脑卒中的时间点提前到6 h内，甚至3 h内的合适的microRNAs，将为防止或减轻脑组织缺血后发生的一系列炎症反应，水肿，坏死以及由此带来的功能障碍，降低患者的病死率和致残程度提供重要帮助。

值得注意的是，在Wang和Sugunavathi Sepramaniam的两组实验给出的缺血性脑卒中后可能上调与下调的miRNA绝大多数并不相同，但都对急性缺血性脑卒中的诊断具有较高的灵敏度和准确性，并且根据不同的预设筛选条件得出了不同的合适条件的miRNA，而结果都是阳性的，这些都说明能作为急性缺血性脑卒中检测标准的生物学标记组合不止一个，以后的研究可能会有更多的循环生物标记组合被发现。

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(2015-03-07收稿2015-09-25修回)

基金项目：国家科技支撑计划课题(项目编号为2013BAH06F04)

【中图分类号】R743

【文献标识码】A

【文章编号】1007-0478(2016)03-0213-03