脑出血实验动物模型研究进展

鲁华山 于长义 田志佳 杨彦龙 李立宏* (解放军第06医院创伤科，吉林 通化 3400; 第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 70038)

·综述·

*通讯作者：李立宏，副主任医师，硕士生导师，E-mail: lihongli777@163.com

脑出血实验动物模型研究进展

鲁华山1于长义1田志佳1杨彦龙2李立宏2*
(1解放军第206医院创伤科，吉林 通化 134001;2第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)

脑出血; 实验动物; 模型; 研究进展

脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是一种发病率和致残率都很高的疾病，其十年生存率只有24.1%。脑出血的实验研究对于了解脑出血的发病原因、发生发展过程、损伤机制、病理生理改变及其预防和治疗都至关重要，而建立稳定性高、可重复性好、能较好的反应其损伤机制的动物模型是该研究的前提。本文对脑出血实验动物模型的动物选择、模型制作方法、各模型的优劣和存在问题及未来展望等进行综述。

一、脑出血动物选择

脑出血动物模型采用啮齿类动物较多，因其价格低廉，体型较小，容易管理和进行实验性手术，且目前已积累了大量关于啮齿类动物的生理、生化、药理、形态学及遗传学等可借鉴的实验基础资料。大多数脑出血采用的是大鼠作为模型，大鼠脑尾壳核是脑内最大核团，易于立体定位，而且尾壳核属基底节，是人类高血压脑出血最好发部位，所以大鼠脑出血模型中多定位于鼠脑尾壳核。兔子耳静脉取血容易，基底节区相对发达，易于穿刺定位，且出血后神经功能缺损明显，在研究脑出血后病理生理改变的研究中较常用，采用兔做模型动物，其各项生理病理及病理变化与灵长类动物很接近，因此是一种较好的脑出血动物模型。犬的生理功能与人类相似性较高，用犬做的脑出血动物模型与人脑出血的情况比较接近。猪脑的解剖结构与人脑很相似、脑容积大、脑实质呈回状、脑白质发达、花费较低、模拟脑出血情况较好，是比较理想的脑出血模型动物。最近，一项关于高原脑出血的动物模型研究[1]就以猪为对象，较好的模拟了高原脑出血的情况。灵长类动物的大脑无论从解剖结构上还是生理功能上讲，都是与人类最接近的动物，因此从模拟效果上讲，灵长类动物无疑是最理想的动物模型选择，可用于神经保护剂等临床前药物的有效性和安全性的评估。但是灵长类动物价格昂贵，使用受到限制，伦理要求高，来源少等均使其不可能大规模用于实验室研究。研究者可根据自己实验目的和要求选择合适的动物做成模型。

二、模型制作方法[2]

目前有关脑出血动物模型的研究文献有很多，但都是在已有方法上的改进，主要可分为4类：脑内注血法和细菌胶原酶注入脑内法应用最广泛，自发性脑出血动物模型最接近临床发病过程，是较为理想的方法，微球囊充胀法已应用较少。其各自特点如下：

1.脑内注血法：脑内直接注入自体动脉血或凝血块是最常用的脑出血模型。20世纪60年代多采用狗、猫、猴等大动物，80年代末以后较多使用大鼠作为实验动物。该方法造成的脑出血模型在一定程度上类似人脑出血的病理过程，而且操作简单，通过立体定向手术可造成各种部位的脑出血。将血液注入到脑内制成脑出血的最早的实验是1982年Ropper等[2]报道的，在1 s内将供体鼠脑室内的血液通过27号儿科腰椎穿刺针注入到模型鼠右侧尾状核，但是该模型没有考虑到供体鼠血液本身对模型的影响和注射压力变化等因素。为了解决这个问题，1994年，有研究[3]用微注射泵把自体血以稳定的速率注射到大鼠右侧尾状核，制作出脑出血模型，该模型具有可控性好、可重复等特点。但是该模型如果注射速度较快就会使血液沿着针道反流、破入脑室系统或是溢到硬膜下。此外，这种模型还有一个缺陷就是不能模拟血压对血肿大小的影响。为了解决反流问题，1996年，Deinsberger等[4]在前一项实验的基础上做了改进，他们先将 5 μl新鲜自体血注入到尾状核中，10 min后待血凝块形成，再将剩余的血液注入到尾状核形成血肿，这种两次注入法有效的减少了血液沿针道反流。但该法注射时间延长易形成血凝块，使得注射难度增大。Belayev等[5]在供体老鼠心脏血液中加入肝素以阻止血凝块形成，但是有研究[6]证明，非肝素化的血液产生的血肿比肝素化的血液产生的血肿更大。近年来，这种“两次注血法”经过研究者改进和动物种类的改变，制作出了一些更好的模型。Yu等[7]采用了一种自制的双套管进行两次注血、三次拔针法造出了一种兔脑基底神经节出血模型。这种双套管由内套管和外套管及针芯组成，外套管长6 mm，由塑料套管组成，内套管长8.5 mm，由不锈钢组成，并带有针芯，首先在兔前囟前2 mm，右侧距中缝线6 mm处的颅骨上做一直径2 mm的钻孔，采用立体定向技术将双套管插入距颅骨6 mm深度的右侧基底神经节处。注血时，将内套管链接到带有微量注射泵的导管上，注血分两步：第一步：以25 μl/min向套管内注血，注射两分钟，共50 μl，然后将针芯插入内套管，在该位置固定7 min；第二步：将内套管向下插入2.5 mm，拔出针芯，以40 μl/min向套管内注血250 μl，再将针芯插入套管内。拔针分三步：第一步：在插入针芯后固定套管7 min，将内套管拔出2.5 mm；第二步：在该位置固定套管8 min后，将两个套管同时拔出3 mm；第三步：该位置固定9 min后，将两个套管同时缓慢拔出。作者认为该方法模拟出血效果明显，可复制性好，能够有效防止血液沿针道返流，并且通过微量注射泵缓慢注射可以防止血液溢出到蛛网膜下腔和脑室内，其过程也与脑出血过程非常接近。

2.细菌胶原酶脑内注入法：细菌胶原酶是一组能特异降解间质和基底膜胶原成分的金属基质蛋白酶，胶原酶有Ⅰ～Ⅷ型，其中Ⅳ型和Ⅶ型细菌胶原酶都可成功用于脑出血动物模型的制备。脑内注入细菌胶原酶20 min后即可损伤脑血管基底膜上的胶原蛋白，破坏血脑屏障。血管壁受损后引起渗血，血液逐渐积聚，约4 h时出血区融合成片状出血，出血区的大小由细菌胶原酶注入量的多少决定。

1990年，Rosenberg等[8]在立体定位下用微量注射泵在9 min内向大鼠尾状核注入含0.01～1.00 U细菌胶原酶(Ⅶ型)的生理盐水2 μl，诱导大鼠脑出血，他们观察到注入胶原酶10 min后即有血液渗出，在0.5 U细菌胶原酶组出血点周围水肿明显，且大鼠死亡率低，所以适合于脑出血的长期实验研究。这种模型的优点是：他是脑实质内血管破裂导致的出血，模拟了自然患者持续出血所致血肿扩大的自然过程，并且可控制出血的位置。但是该模型的不足之处在于细菌胶原酶可引起严重的炎症反应。此外，还有人在不断改进该模型，如改变注射的时间、注射量、在细菌胶原酶加入肝素等。

3.自发性脑出血动物模型：自发性脑出血动物模型主要有两种：一种是改变遗传基因获得的易卒中自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive cerebral hemorrhage in rat, SHCHR)，1980年，Ogata等[9]报道了这种模型，将有恶性高血压的大鼠的后代进行近亲交配获得。这种模型卒中率高，能重现人类自发性脑出血发病过程，但因存在遗传局限性，易变种、断种，饲养困难，且价格高、来源少而限制了其在脑出血研究中的广泛应用。另一种是肾血管性高血压大鼠(renovascular hypertensive rats, RHR)，1998年，Zeng等[10]用直径为0.3 mm的银夹钳夹大鼠的双侧肾动脉，制作出了该模型。这种模型易于建立，无遗传缺陷，无须人工遗传诱导，可用一般正常大鼠作对照研究，且有与人类脑出血相似的高血压动脉硬化病理生理基础。但与易卒中型自发性高血压大鼠(SHCHR)相比，其自发性脑出血的发生率较低，并且出血量及出血区域同样无法控制。Chelko等[11]对肾动脉夹进行改进从而提高了造模成功率。相比于SHCHR，RHR廉价易得、造模简单且易于饲养。但两者都存在脑出血的部位和出血量不易控制的问题，所以目前应用受到了限制。Wu等[12]在SHRSP基底节区注入自体血制作脑出血模型，将改变遗传基因的方式和自体血注入法结合，但研究发现血压的缓慢升高加重脑出血后神经损伤，并不能使血肿和周围水肿带扩大。Wakisaka等[13]报道了一种药物诱导高血压脑出血动物模型，给C57BL/6小鼠输注人Ang II和一氧化氮合酶抑制剂诱导产生慢性高血压，再通过注射Ang II进而产生急性高血压，从而发生高血压脑出血。此外，基因工程实验动物模型也在逐步被人们研究，基因敲除小鼠使我们对脑出血后脑损伤机制有了进一步了解。由于自发性脑出血动物模型在脑出血的部位和出血量方面都还不易控制，所以目前自发性脑出血模型应用还不是很广泛，但由于其更接近自然脑出血发生发展过程，所以如果能克服上述缺点，自发性脑出血模型应该是最理想的脑出血模型。

4.微球囊充胀法：这是一种纯机械性的脑出血模型，主要用来模拟脑出血的占位效应。该法是1987年，由Sinar等[14]发明，他们在SD大鼠颅骨上定位钻孔，将微球囊置于25号钝性针头上，插入大鼠右侧尾状核，静置30 min后，在平均压为13.3 kPa下，20 s内将微球囊充胀至50 μl，保留10 min后抽出。通过调节球囊内液体量，可模拟不同血肿大小，从理论上讲可用于研究脑出血血肿的占位效应和血肿后神经行为学的改变。Lopez Valdes等[15]在此基础上采用微球囊充气和放气的方法模拟血肿形成和清除的过程，研究外科血肿清除术的最佳治疗时机及临床疗效。但是这种模型仅仅只能模拟脑出血后占位病变引起的的各种病理生理改变，有许多研究证实脑出血后还有其他因素造成的损害，如：血肿的血管活性物质释放、血液本身的成分如凝血酶、血红蛋白、血浆蛋白、缺氧及氧化应激等。因此，由于以上三种研究的发展，目前已较少使用该方法了。

三、各模型对比及存在问题

以上动物模型各有优缺点，血液注入法和胶原酶注入法在技术上很相似，他们都容易制作、可复制性好，对血肿大小和血肿部位比较容易控制，而细菌胶原酶注入法更容易模拟自然脑出血发生发展过程，但目前缺乏两者注入后的恢复情况的对比研究。细菌胶原酶相对于自体血来讲是异物，而自体血注入可以避免这个问题，从而更好的模拟出血后对脑的损伤。这两种模型在目前应该是最广泛的。自发性脑出血动物目前也常用于脑损伤后脑出血机制的研究，由于难以控制出血量和出血部位，相对于前两种模型这种模型应用还不多。微球囊充胀法在模拟脑出血发生发展和损伤及其治疗上显然不及前三种模型，故已较少应用了。

到目前为止，没有哪一种模型可以十分理想的模拟真实的自然脑出血，这些动物模型对我们了解脑出血的病理生理机制等必不可少，但是它们不能取代更多的临床相关模型。目前脑出血实验动物模型标准还不够标准，许多实验动物模型还存在问题，比如我们在实验中常常用健康年幼雄性大鼠，没有考虑到年龄性别并发症等对实验结果的影响，有的实验没有使用随机性分组，缺乏随机对照等，还有一些统计学上的问题也常常出现，因此，目前应该建立一个更加严格的脑出血模型评价体系。

四、未来展望

尽管目前的动物模型还有许多需要改进的地方，但是也有许多治疗性的探讨研究已在动物模型上得到证实，如：Bao等[16]在大鼠脑出血模型上研究出了骨髓间充质细胞中的Flk-1(+)对大鼠脑出血后行为恢复、减轻炎症反应及促进血管生成的作用；Yang等[17]研究了他汀类药物对自体血注入大鼠模型的血脑屏障的保护作用；Zhou等[18]研究了止血剂联合利伐沙班对注入细菌胶原酶的大鼠脑出血模型的治疗作用；Rolland等[19]研究了芬戈莫德减少啮齿类动物脑出血后淋巴细胞的渗透作用。近两年来，有关脑出血的相关动物研究越来越多，但是还有许多未知的潜在因素可能还未被发现，所以，不断改进动物模型，解决脑出血从实验研究到临床应用的转化才是未来研究的关键。

综上所述，脑出血动物的选择各有特点，造模方法各有优劣，但是没有哪一种动物模型可以完全模拟人脑出血发生发展过程及其损伤机制，只有研究者不断探索，积极发现，才能找到一种更好的模拟脑出血机制的动物模型，并推动脑出血的实验进展，最终转化到临床应用。

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4Deinsberger W, Vogel J, Kuschinsky W, et al. Experimental intracerebral hemorrhage: Description of a double injection model in rats [J]. Neurol Res, 1996, 18(5): 475-477.

5Belayev L, Saul I, Curbelo K, et al. Experimental intracerebral hemorrhage in the mouse: Histological, behavioral, and hemodynamic characterization of a double-injection model [J]. Stroke, 2003, 34(9): 2221-2227.

6Xi G, Keep RF, Hoff JT. Erythrocytes and delayed brain edema formation following intracerebral hemorrhage in rats [J]. J Neurosurg, 1998, 89(6): 991-996.

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8Rosenberg GA, Mun-Bryce S, Wesley M, et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats [J]. Stroke, 1990, 21(5): 801-807.

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鲁华山，医师，E-mail: starry_sky_1986@yeah.net

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