石墨烯类材料在组织工程中的应用

邹亚光　魏皎　综述　李青峰　审校



石墨烯类材料在组织工程中的应用

邹亚光魏皎综述李青峰审校

【提要】石墨烯是一种具有独特理化性质的二维晶体纳米材料，在各个领域中都有广泛应用，但在再生医学方面的研究尚处于早期阶段。我们就石墨烯类材料的细胞毒性，及其诱导干细胞向成骨、成神经、成心肌、成脂方向分化的相关研究进行综述。

【关键词】石墨烯细胞毒性分化

作者单位：200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

Application of Graphene-based Materials in Tissue Engineering

ZOU Yaguang,WEI Jiao,LI Qingfeng.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China.Corresponding author:LI Qingfeng(E-mail:dr.liqingfeng@yahoo.com).

【Summary】Graphene is a kind of atomic crystal nanomaterial arranged in a two-dimensional structure with extraordinary physicochemical properties,which have been extensively employed in various fields.However the application of graphene in regenerative medicine is still in an early phase.In this paper,the study of toxicity of graphene-based materials and its ability of inducing stem cell differentiation into osteogenic,neuronal,cardiomyogenic and adipogenic lineages were reviewed.

【Key words】Graphene;Cell toxicity;Differentiation

碳元素作为地球上最常见的元素之一，是生物体内化学反应过程中不可缺少的一部分。由于碳原子之间的共价键存在多种轨道杂化方式（sp，sp2，sp3），碳元素拥有为数众多的同素异形体，如金刚石、石墨、足球烯等。2004年，Novoselo和Geim成功地通过实验从石墨中分离出石墨烯，并证实其可以单独存在[1]。此后，石墨烯类材料就以其独特的理化特性成为各领域研究的焦点[2-3]。

石墨烯是一种二维平面多环芳香烃原子晶体，碳原子以sp2杂化轨道形成蜂巢晶格，保持着严格的二维结构且非常稳定[4]。通过不同小分子基团的化学修饰，石墨烯的分子结构可发生改变并形成多种衍生物，常见的石墨烯类材料包括氧化石墨烯（GO）、还原氧化石墨烯（r-GO）、多层石墨烯、超薄石墨、碳纳米管（CNT）、石墨烯纳米片（GNS）等，这些性质各异的材料共同构成了庞大的石墨烯纳米材料家族（GNFs）[5-7]。同时，石墨烯类材料还能与生物相容聚合物材料结合，形成更为复杂的多功能的复合物。

石墨烯是最薄、最坚硬的纳米材料，其光学性质、导热性能、导电能力均非常优秀[1，8-12]，广泛应用于纳米生物传感器[13]、太阳能电池、近红外标记探针、光敏剂等不同领域[14-15]；而石墨烯的高比表面积[16]及疏水性带来的对各类药物分子的吸附性，使其在药物的靶向运输上也拥有巨大的潜力[17-19]。

尽管石墨烯类材料在工业、微电子等领域中已经得到了广泛的应用，但其在医学，尤其是再生医学中的研究，依然处在相当早期的阶段。我们就石墨烯及其衍生物近年来在组织工程领域的研究进展进行综述。

1　石墨烯类材料的毒性研究

当石墨烯及其衍生物被应用于生物领域时，其生物毒性一直是研究的焦点，但由于并不存在一个特征性的参数来衡量纳米材料的细胞毒性，因此需要从体内外等多方面来进行衡量。大量的研究表明，单纯的石墨烯能够引起细胞的氧化应激与炎症反应，存在一定的细胞毒性[20-21]。

在Zhang等[22]的体外研究中，石墨烯与单壁碳纳米管以0.1～100 μg/mL的不同浓度来测试对嗜铬神经细胞瘤细胞系PC12的影响。两种材料均表现出了与浓度相关的细胞毒性。而石墨烯对细胞产生了更强的氧化应激反应，介导Caspase-3活化，导致细胞凋亡。结果表明，天然石墨烯的体外生物毒性存在一定的形状相关性与浓度依赖性。而Chauhan等[23]的研究也表明，直径＞5 nm的石墨烯材料容易在体内堵塞毛细血管，引发炎症反应，而相对直径较小的材料则容易被肾脏排泄。

Sasidharan等[24]测试了不同浓度的氧化石墨烯与羧基化的氧化石墨烯在猴肾细胞中的毒性作用。结果表明，氧化石墨烯会积聚在细胞膜表面，破坏F-actin蛋白的稳定性，造成浓度依赖性的氧化应激，影响细胞骨架的形态，最终导致细胞凋亡；而羧基化的氧化石墨烯在任何浓度下均未表现出明显的细胞毒性。其他相似的研究也证实了氧化石墨烯虽然毒性小于石墨烯，但在一定浓度下也会造成细胞的氧化应激与蛋白质、DNA的损伤和细胞凋亡，而通过更多适当的含氧基团的修饰，可以削弱石墨烯疏水键与细胞间的相互作用，降低其毒性[19，25-28]。另外，同属石墨烯材料家族的还原氧化石墨烯，在体外实验中也导致细胞活力显著降低，表现出明显的细胞毒性[29]。

进一步研究表明，石墨烯类材料通过表面修饰和功能化能够降低生物毒性，增加生物相容性，甚至促进细胞增殖。Liao等[30]报道了使用壳聚糖被覆的氧化石墨烯成功解决了普通氧化石墨烯带来的溶血副作用。Yang等[14，31-32]介绍了聚乙二醇（PEG）偶联的石墨烯类材料（包括石墨烯与氧化石墨烯）在生物体内毒性的改善，包括体外毒性的降低，体内在网状内皮系统内潴留较少，肿瘤细胞内积聚增多，对血液系统、消化系统没有明显的毒副作用等。同时，他们也报道了葡聚糖（Dextran）功能化的氧化石墨烯能够显著增加细胞的体外活性，促进细胞的增殖，并在体内增加肝脏与脾脏对材料的吸收与代谢，减少其短期毒性[33]。

综上所述，尽管石墨烯类材料存在有一定的体外毒性，材料本身的形状、大小、浓度，以及培养细胞的种类、状态均会对其毒性造成影响，但通过一定程度的化学修饰及高分子材料的功能化能够有效地降低材料本身的毒性，改善生物相容性，并促进其在生物体内的靶向、分解与代谢。因此，在生物医学领域，功能化的石墨烯材料是一种安全的选择。

2　石墨烯类材料与细胞分化的研究

因具有高生物兼容性，低毒性，高比表面积，对各类小分子物质较强的吸附能力等物理化学性质，石墨烯类材料在组织工程领域有着良好的应用前景。目前的研究主要包括①将石墨烯类纳米材料溶解于干细胞培养液中，检测其对干细胞体外分化的影响；②将石墨烯类材料单独或与高分子材料进行偶联，制成生物支架，研究干细胞在其表面的黏附、增殖、分化[34-35]。目前已有大量的研究表明，石墨烯类材料能够促进干细胞多向分化。

2.1成骨方向研究

骨组织工程一直致力于研究不同材料诱导干细胞向成骨方向分化，以填补因严重损伤或先天性残疾等因素造成的骨缺损。研究表明，石墨烯类材料能显著增强现有支架材料的生物相容性，并促进干细胞的黏附、增殖及分化[36]。

Kalbacova等[37]将石墨烯被覆于二氧化硅材料表面，并在其上种植成骨细胞与hBMSC。培养48 h后，被覆组材料上的细胞相比对照组具有更强的黏附性和增殖能力。Nayak等[38-39]则先后使用聚乙二醇偶联的碳纳米管与石墨烯被覆的PET、PDMS、Si/SiO2等材料来检测不同硬度的基底材料上石墨烯类材料对BMSCs成骨分化能力的影响。结果表明，实验组BMSCs出现了显著的成骨细胞标志物降钙素（OCN）的表达，而对照组中的细胞则依旧CD44阳性表达（BMSC的特征性标志）；在茜素红染色中，实验组也出现了更多的钙沉积。证明了石墨烯材料是促进干细胞成骨分化的重要因素，与基底材料的种类没有明显的相关性。

Pan等[40]发现，种植于碳纳米管复合支架上的BMSCs使用普通干细胞培养液（不含诱导因子），也能诱导分化成骨，并高表达碱性磷酸酶，认为可能与材料在空间上的形态有一定的关系。Crowder等[41]的研究表明，三维泡沫状结构的石墨烯材料同样能够诱导hBMSCs向成骨方向分化。研究发现，氧化石墨烯材料能够促进hBMSCs成骨方向分化[42]。种植于氧化石墨烯被覆钛金属材料表面的hBMSCs在2～3周后出现了更显著的骨形态发生蛋白（BMP-2）的表达。

2.2神经方向研究

目前，自体神经移植仍然是神经损伤修复的首选方案，然而，供区的缺乏与移植后供区神经功能的缺损一直是无法解决的问题[43]。因此，构建组织工程化神经以供移植，被视为最佳的替代方案[44]。相关研究中，常以神经干细胞或胚胎干细胞作为种子细胞，并以一定的电刺激作为诱导分化的条件。石墨烯类材料以其优异的电学特性和对干细胞良好的生物相容性被广泛地应用[45]。

相关研究表明，石墨烯被覆的材料相比对照组更能促进NSCs或神经细胞瘤细胞PC-12的黏附与增殖，并促进其向神经元细胞方向分化[46-47]。氧化石墨烯与还原氧化石墨烯被覆的材料能在一定条件刺激下（电刺激、光刺激）促进ESCs 与NSCs分化为神经元细胞，并抑制其向神经胶质细胞的分化[48-49]。

Li等[50]发现，三维结构的石墨烯支架更能促进神经干细胞的黏附，并能通过更好的导电性传递电刺激促使干细胞向神经元细胞分化。Wang等[51]的研究则表明，氟化的石墨烯材料相较于传统的纯石墨烯，能更为显著地促进MSCs向神经细胞方向分化。而Chao等[52]的研究也表明，碳纳米管与聚丙烯酸复合材料能够很好地消除原有聚丙烯酸对神经分化的不良影响，并促进ESCs神经方向的分化[53]。

2.3心肌方向研究

石墨烯类材料良好的导电性同样被应用于促进心肌细胞增殖与干细胞向心肌方向分化的生物支架材料中。碳纳米管的纳米几何结构与人心脏组织细胞外基质结构非常相似，Stout等[54]将碳纳米管与聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）材料相结合，探究复合支架与心肌细胞的相互影响。研究表明，结合了碳纳米管的支架上，心肌细胞的密度接近对照组的5倍。Mooney等[55]则将hMSCs种植于碳纳米管与聚乳酸材料（PLA）的复合支架上，经一定的电刺激，发现hMSCs显著表现出向心肌前体细胞分化的趋势，其心肌相关蛋白Nkx2.5、GATA-4、心肌肌钙蛋白T与心肌缝隙连接蛋白43明显上调。

不仅仅局限于碳纳米管，Lee等[56]也报道了玻璃黏连蛋白（VN）被覆的石墨烯材料能够促使种植其上的ESCs中与内胚层、中胚层分化相关的基因表达逐步上调，并随后向心肌方向分化。研究认为，这一分化过程与石墨烯促进培养环境中细胞外基质蛋白与信号分子表达上调有关[57]。

2.4成脂方向研究

Lee等[58]将hMSCs种植在覆有石墨烯与氧化石墨烯的聚二甲基硅氧烷（PDMS）材料表面，经14 d的成脂诱导后，油红染色显示氧化石墨烯材料组能够显著地促进hMSCs成脂方向的分化，说明氧化石墨烯能够浓缩成脂诱导液的成分，是有效促进分化的平台。然而石墨烯材料组却明显抑制了其分化，可能与石墨烯促使胰岛素变性有关。另有类似研究显示，氧化石墨烯能够促进hADSCs在材料表面的黏附与增殖，同时也显著提高了hADSCs向成骨、上皮方向的分化能力，并抑制其向成软骨方向分化[34]。

近年来，石墨烯类材料在组织工程领域的研究中，体内与体外的实验均证实其能促进组织的修复与重建，甚至已有一部分临床试验获得开展。但是该材料对细胞的潜在毒性不容忽视，众多因素均对其毒性的评估有着至关重要的影响。只有尽早地建立相关材料的加工流程规范与精确的生物相容性评估系统，才能使石墨烯类材料摆脱安全性的争议。

虽有大量的研究表明石墨烯与其衍生物氧化石墨烯等材料能显著促进干细胞黏附、增殖，并向各个方向分化，但其确切的机制仍不明确。目前的研究认为，石墨烯类材料以其独特的纳米微观结构（如不同形态材料表面对细胞的张力）、高比表面积，以及强大的吸附能力，使大量生长因子、蛋白质等营养物质能聚集、浓缩其表面，作为一种干细胞巢，影响细胞分子信号通路的表达，从而诱导干细胞的分化。而外源性协同的电与光学的刺激，及复合材料带来的特性，也能很大程度影响石墨烯对干细胞分化的作用。进一步深入研究石墨烯与干细胞间的相互作用，将对石墨烯类材料在组织工程领域中的应用提供更坚实的理论基础。

尽管石墨烯在医学方面的研究仍处于早期阶段，但凭借其优异的理化特性和良好的生物相容性，石墨烯类材料在组织工程领域有着极大的应用前景，有望为先天性或严重损伤造成的组织缺损带来新的解决方案。

参考文献

[1]Novoselov KS,Geim AK,Morozov SV,et al.Electric field effect in atomically thin carbon films[J].Science,2004,306(5696):666-669.

[2]Geim AK,Novoselov KS.The rise of graphene[J].Nat Mater, 2007,6(3):183-191.

[3]Geim AK.Random walk to graphene(Nobel Lecture)[J].Angew Chem Int Ed,2011,50(31):6966-6985.

[4]Stankovich S,Dikin DA,Dommett GHB,et al.Graphene based composite materials[J].Nature,2006,442(7100):282-286.

[5]Jastrzebska AM,Kurtycz P,Olszyna AR.Recent advances in graphene family materials toxicity investigations[J].J Nanopart Res,2012,14(12):149-158.

[6]Kim KS,Zhao Y,Jang H,et al.Large-scale pattern growth of graphene films for stretchable transparent electrodes[J].Nature, 2009,457(7230):706-710.

[7]Sanchez VC,Jachak A,Hurt RH,et al.Biological interactions of graphene-family nanomaterials:an interdisciplinary review[J]. Chem Res Toxicol,2012,25(1):15-34.

[8]Meyer JC,Geim AK,Katsnelson MI,et al.The structure of suspended graphene sheets[J].Nature,2007,446(7131):60-63.

[9]Mueller T,Xia F,Avouris P.Graphene photodetectors for highspeed optical communications[J].Nat Photonics,2010,4(5):297-301.

[10]Balandin AA,Ghosh S,Bao W,et al.Superior thermal conductivity of single-layer graphene[J].Nano Lett,2008,8(3):902-907.

[11]Palacios T.Graphene electronics:thinking outside the silicon box [J].Nat Nanotechnol,2011,6(8):464-465.

[12]Service RF.Carbon sheets an atomthick give rise to graphene dreams[J].Science,2009,324(5929):875-877.

[13]Pumera M.Graphene in biosensing[J].Mater Today,2011,14(7): 308-315.

[14]Yang K,Zhang S,Zhang GX,et al.Graphene in mice:ultrahigh in vivo tumor uptake and efficient photothermal therapy[J].Nano Lett,2010,10(9):3318-3323.

[15]Robinson JT,Tabakman SM,Liang YY,et al.Ultrasmall reduced graphene oxide with high near-infrared absorbance for photothermal therapy[J].J Am Chem Soc,2011,133(17):6825-6831.

[16]Park S,Ruoff RS.Chemical methods for the production of graphenes[J].Nat Nanotechnol,2009,4(4):217-224.

[17]Liu Z,Robinson JT,Sun XM,et al.PEGylated nanographene oxide for delivery of water-insoluble cancer drugs[J].J Am Chem Soc,2008,130(33):10876-10877.

[18]Yang XY,Zhang XY,Liu ZF,et al.High-efficiency loading and controlled release of doxorubicin hydrochloride on graphene oxide[J].J Phys Chem C,2008,112(45):17554-17558.

[19]Bao HQ,Pan YZ,Ping Y,et al.Chitosan-functionalized graphene oxide as a nano-carrier for drug and gene delivery[J].Small, 2011,7(11):1569-1578.

[20]Yang ST,Wang X,Jia G,et al.Long-term accumulation and low toxicity of single-walled carbon nanotubes in intravenously exposed mice[J].Toxicol Lett,2008,181(3):182-189.

[21]Zhang Y,Petibone D,Xu Y,et al.Toxicity and efficacy of carbon nanotubes and graphene:the utility of carbon-based nanoparticles in nanomedicine[J].Drug Metab Rev,2014,46(2):232-246.

[22]Zhang YB,Ali SF,Dervishi E,et al.Cytotoxicity effects of graphene and single-wall carbon nanotubes in neural phaeochromocytomaderived PC12 cells[J].ACS Nano,2010,4(6):3181-3186.

[23]Chauhan VP,Stylianopoulos T,Martin JD,et al.Normalization of tumour blood vessels improves the delivery of nanomedicines in a size-dependent manner[J].Nat Nanotechnol,2012,7(6):383-388.

[24]Sasidharan A,Panchakarla LS,Chandran P,et al.Differential nano-bio interactions and toxicity effects of pristine versus functionalized graphene[J].Nanoscale,2011,3(6):2461-2464.

[25]Lv M,Zhang Y,Liang L,et al.Effect of graphene oxide on undifferentiated and retinoic acid-differentiated SH-SY5Y cells line[J].Nanoscale,2012,4(13):3861-3866.

[26]Vallabani NV,Mittal S,Shukla RK,et al.Toxicity of graphene in normal human lung cells(BEAS-2B)[J].J Biomed Nanotechnol, 2011,7(1):106-107.

[27]Chowdhury SM,Lalwani G,Zhang K,et al.Cell specific cytotoxicity and uptake of graphene nanoribbons[J].Biomaterials,2013,34(1): 283-293.

[28]Hu W,Peng C,Lü M,et al.Protein corona-mediated mitigation on cytotoxicity of graphene oxide[J].ACS Nano,2011,5(5):3693-3700.

[29]Chang YL,Yang ST,Liu JH,et al.In vitro toxicity evaluation of graphene oxide on A549 cells[J].Toxicol Lett,2011,200(3):201-210.

[30]Liao KH,Lin YS,Macosko CW,et al.Cytotoxicity of graphene oxide and graphene in human erythrocytes and skin fibroblasts [J].ACS Appl Mater Interfaces,2011,3(7):2607-2615.

[31]Yang K,Wan J,Zhang S,et al.In vivo pharmacokinetics,longterm biodistribution,and toxicology of pEGylated graphene in mice[J].ACS Nano,2010,5(1):516-522.

[32]Yang K,Wan J,Zhang S,et al.The influence of surface chemistry and size of nanoscale graphene oxide on photothermal therapy of cancer using ultra-low laser power[J].Biomaterials,2012,33(7): 2206-2214.

[33]Zhang S,Yang K,Feng L,et al.In vitro and in vivo behaviors of dextran functionalized graphene[J].Carbon,2011,49(12):4040-4049.

[34]Kim J,Choi KS,Kim Y,et al.Bioactive effects of graphene oxide cell culture substratum on structure and function of human adiposederived stem cells[J].J Biomed Mater Res A,2013,101(12): 3520-3530.

[35]Mooney E,Dockery P,Greiser U,et al.Carbon nanotubes and mesenchymalstemcells:biocompatibility,proliferationand differentiation[J].Nano Lett,2008,8(8):2137-2143.

[36]Gupta A,Woods MD,Illingworth KD,et al.Single walled carbon nanotube composites for bone tissue engineering[J].J Orthop Res,2013,31(9):1374-1381.

[37]Kalbacova M,Broz A,Kong J,et al.Graphene substrates promote adherence of human osteoblasts and mesenchymal stromal cells [J].Carbon,2010,48(15):4323-4329.

[38]Nayak TR,Jian L,Phua LC,et al.Thin films of functionalized multiwalled carbon nanotubes as suitable scaffold materials for stem cells proliferation and bone formation[J].Acs Nano,2010,4 (12):7717-7725.

[39]Nayak TR,Andersen H,Makam VS,et al.Graphene for controlled and accelerated osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].Acs Nano,2011,5(6):4670-4678.

[40]Pan L,Pei X,He R,et al.Multiwall carbon nanotubes/polycaprolactone composites for bone tissue engineering application[J]. Colloids Surf B Biointerfaces,2012,93(1):226-234.

[41]Crowder SW,Prasai D,Rath R,et al.Three-dimensional graphene foams promote osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J].Nanoscale,2013,5(10):4171-4176.

[42]La WG,Park S,Yoon HH,et al.Delivery of a therapeutic protein for bone regeneration from a substrate coated with graphene oxide [J].Small,2013,9(23):4051-4060.

[43]Yao L,de Ruiter GC,Wang H,et al.Controlling dispersion of axonal regeneration using a multichannel collagen nerve conduit [J].Biomaterials,2010,31(22):5789-5797.

[44]Saracino GA,Cigognini D,Silva D,et al.Nanomaterials design and tests for neural tissue engineering[J].Chem Soc Rev,2013, 42(1):225-262.

[45]Jan E,Kotov NA.Successful differentiation of mouse neural stem cells on layer-by-layer assembled single-walled carbon nanotube composite[J].Nano Letters,2007,7(5):1123-1128.

[46]Park SY,Park J,Sim SH,et al.Enhanced differentiation of human neural stem cells into neurons on graphene[J].Adv Mater, 2011,23(36):H263-H267.

[47]Hong SW,Lee JH,Kang SH,et al.Enhanced neural cell adhesion and neurite outgrowth on graphene-based biomimetic substrates [J].Biomed Res Int,2014,2014:212149.

[48]Yang D,Li T,Xu M,et al.Graphene oxide promotes the differentiation of mouse embryonic stem cells to dopamine neurons [J].Nanomedicine(Lond),2014,9(16):2445-2455.

[49]Akhavan O,Ghaderi E.Flash photo stimulation of human neural stem cells on graphene/TiO2 heterojunction for differentiation into neurons[J].Nanoscale,2013,5(21):10316-10326.

[50]Li N,Zhang Q,Gao S,et al.Three-dimensional graphene foam as a biocompatible and conductive scaffold for neural stem cells [J].Sci Rep,2013,3:1604.

[51]Wang Y,Lee WC,Manga KK,et al.Fluorinated graphene for promoting neuro-induction of stem cells[J].Adv Mater,2012,24 (31):4285-4290.

[52]Chao TI,Xiang S,Chen CS,et al.Carbon nanotubes promote neuron differentiation from human embryonic stem cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2009,384(4):426-430.

[53]Li B,Ma Y,Wang S,et al.Influence of carboxyl group density on neuron cell attachment and differentiation behavior:gradientguided neurite outgrowth[J].Biomaterials,2005,26(24):4956-4963.

[54]Stout DA,Basu B,Webster TJ.Poly(lactic-co-glycolic acid): carbon nanofiber composites for myocardial tissue engineering applications[J].Acta Biomaterialia,2011,7(8):3101-3112.

[55]Mooney E,Mackle JN,Blond DJ,et al.The electrical stimulation of carbon nanotubes to provide a cardiomimetic cue to MSCs[J]. Biomaterials,2012,33(26):6132-6139.

[56]Lee TJ,Park S,Bhang SH,et al.Graphene enhances the cardiomyogenic differentiation of human embryonic stem cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,2014,452(1):174-180.

[57]Park J,Park S,Ryu S,et al.Graphene-regulated cardiomyogenic differentiation process of mesenchymal stem cells by enhancing the expression of extracellular matrix proteins and cell signaling molecules[J].Adv Healthc Mater,2013,3(2):176-181.

[58]Lee WC,Lim CH,Shi H,et al.Origin of enhanced stem cell growth and differentiation on graphene and graphene oxide[J]. Acs Nano,2011,5(9):7334-7341.

收稿日期：（2015年11月2日；修回日期：2015年12月20日）

通讯作者：李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@yahoo.com）。

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.01.013

【中图分类号】R318.08

【文献标识码】A

【文章编号】1673－0364（2016）01－0048－04