Notch信号转导通路对软骨发育分化的影响

陆晓娜　综述　范飞　审校



Notch信号转导通路对软骨发育分化的影响

陆晓娜综述范飞审校

【提要】Notch信号转导通路广泛存在于多种动物细胞中，对调节细胞的增殖、存活、分化和凋亡等过程有重要意义，其受体和配体都是跨膜蛋白，因此是介导细胞间通讯的一种重要方式。软骨的分化发育起始自间充质细胞的凝集，Notch家族在软骨形成过程中的表达呈多样性，并对软骨的发育分化呈现时间和空间的调控。在此就Notch信号转导通路的组成、分布、转导机制及其对软骨分化发育的影响进行综述。

【关键词】Notch信号软骨发育分化

作者单位：100144北京市中国医学科学院，北京协和医学院整形外科医院。

Notch Signaling in Chondrogenic Development and Differentiation

LU Xiaona,FAN Fei.Plastic Surgery Hospital,

Chinese Academy of Medical Sciences,Peking Union Medical College,Beijing 100144,China.Corresponding author:FAN Fei(E-mail:fanfei1962@gmail.com).

【Summary】Notch signaling widely exists in many kinds of animal cells,and it is important to regulate cell proliferation, survival,differentiation and apoptosis.As both its receptor and ligand are trans-membrane proteins,Notch signaling is significant in mediating communication between cells.The chondrogenic development and differentiation start from the agglutination of ectomesenchymal cells.Notch family expresses diversely in the formation of cartilages,regulating them depending on time and space.In this paper,the composition,distribution and transduction mechanisms of Notch signaling and its effects on chondrogenic development and differentiation were reviewed.

【Key words】Notch signaling;Cartilage;Development;Differentiation

Notch通道是生物进化过程中一组高度保守的信号转导通路，通过细胞间的相互作用在胚胎时期即可决定细胞的命运，因而在多种组织和器官的发育分化中起重要作用。Notch最早以一个突变基因在黑腹菌属果蝇中被发现。1914年，Dexter[1]发现了第一次Notch突变，表现为性别相关，主要在雌性果蝇中出现，但会对雄性果蝇产生致死效应。1917年，Bridges[2]发现了这个基因的第二个突变体。该基因功能的部分缺失可导致果蝇翅缘出现缺口[3-4]。Artavanis-Tsakonas等[5]在1983年首次成功克隆了Notch基因。自从发现Notch信号后，一直试图了解其多效性潜能及决定细胞增殖、凋亡和分化的作用。

1　Notch通道的组成

Notch通道由Notch受体、配体、CSL蛋白、信号效应分子及相关的酶组成。目前，已知4个Notch受体和12个配体，所有的受体、配体都是跨膜蛋白，其信号转导作用依赖相邻细胞间受配体的结合。

1.1Notch受体

Notch受体由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区参与配体的结合及Notch的活化，胞内区是高度保守的区域，参与蛋白-蛋白相互作用。哺乳动物的Notch受体包括4个（Notch 1-4）[6]，每个受体包含1个胞外域，此区域包含对配体-受体相互作用有重要影响的表皮生长因子重复序列、半胱氨酸富集区，以及3个Notch/LIN-12重复结构。胞内区有6个串联锚定蛋白重复区，谷氨酸富集区，PEST区（脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸）及1个Ram区。

1.2Notch配体

Notch配体胞外区有数量不等的EGF样重复序列和1个保守的富含半胱氨酸位点，即DSL结构域，可通过该区域与受体相互作用。Notch配体根据结构基元分4组[7-8]：①DSL （Delta/Serrate/LAG-2）/DOS（Delta和OSM-11-like proteins）-含配体DLL1（Delta-like1），JAG1和JAG2；②DSL单一配体DLL3和DLL4；③DOS共同配体DLK1和DLK2；④非经典配体DNER，MAGP1，MAGP2，F3/Contactin1和NB-3/Contactin6。

1.3Notch信号效应分子及相关酶类

Jag1介导的Notch信号对人骨髓间充质干细胞的软骨形成起关键作用[9]。PS1在软骨形成初期起调控作用[10]。活化的转录复合物诱导bHLH家族基因[11]，如HES家族基因及HES相关的YRPF家族基因HEY的表达。HES和HEY家族基因作为转录阻遏物调控始祖肌肉、神经和造血系统细胞的命运[12]。HES家族6个成员中发挥最大作用的是Hes1和Hes5[13]。Hes1是与软骨形成相关的一个靶基因，其表达水平代表Notch1的信号强度。其机制是结合分化效应启动子，募集Groucho/TLE等转录共抑制因子，阻碍分化效应基因的表达，及抑制Cyclin依赖性激酶抑制因子p27Kip1的转录。Hes5广泛分布于胎儿和成人组织中，与软骨分化相关并有显著促进细胞增殖的作用[14]。γ-分泌酶复合体由presenilin1（PS1）和presenilin2（PS2）以及调节组件PEN2、Aph1和NCT组成[15]。

2　Notch通道的分布

Notch信号家族受配体的分布不同，在软骨形成过程中的表达也不同。Notch1，Delta1，Jagged1和Jagged2表达于软骨间质发育的早期阶段，随后Notch2，Notch3和Notch4的表达增加，但在软骨形成的最后阶段不表达[16]。Notch2、Notch4、Delta 和Jagged2广泛分布于软骨原生细胞中，于正发育的软骨细胞中表达。在软骨形成早期，Notch1明显定位于凝集的间充质中。

免疫定位研究表明，Notch受体和配体存在于小鼠和牛的关节软骨中[17]。Notch2受体广泛分布于整个关节软骨和骨骺生长板，在增殖、前肥厚性和肥厚性软骨中表达。如此广泛分布的确切原因尚不清楚，但推测Notch2可能调节Notch1 和Notch3，从而影响软骨的发育和生长及体内成熟组织的平衡状态。Notch1定位于关节软骨表面区，此处有可分化为结缔组织细胞系的软骨祖细胞池。Notch3定位于关节软骨深层和骨骺生长板的肥厚性软骨，可在A7r5-N3IC细胞（一种稳定转染的血管平滑肌细胞）尚未融合时即阻止细胞增殖，同时促进细胞融合的进程[18]。这表明Notch3与阻止终末分化的软骨细胞增殖有关。

Oldershaw等[19]通过PCR检测发现，Jaggedl在软骨形成早期表达量增高，之后降低。Jaggedl过表达的Notch下游靶基因Hey1表达明显激活，说明Jaggedl启动了Notch信号通路。将转染Jaggedl的hMSC在三维细胞聚团培养中诱导成软骨时，软骨的形成受到了抑制。说明在hMSC中，由Jaggedl介导的Notch信号通路为启动成软骨所必需，但是它必须被关闭才能使软骨的生成得以继续。

Hilton等[20]完成了最早的，有关Notch信号通路对软骨和骨分化作用的体内实验，Notch信号通路的上游部分（PSEN1 和PSEN2或NOTCH1和NOTCH2），通过Prx1Cre转基因条件性脱离小鼠肢体间充质干细胞（MPCs），提示Notch信号通路在MPCs的缺失时，可导致胚胎时期软骨成熟的起始及终末成熟的延迟。研究表明，在双向分化潜能的COP细胞中，使用Col2Cre转基因使经典Notch受体缺失，早期可加速软骨成熟，但最终导致软骨终末成熟和细胞凋亡的延迟。

3　Notch通道的作用机理

3.1Notch通道的激活

Notch信号通路的激活需要经过连续的酶解过程，使受体胞内区释放，与胞核内转录因子CSL相互作用，调节靶基因的表达。研究表明，CSL依赖的Notch信号通路没有调节Notch的全部功能[8，21]。因此，Notch可能以两种不同的过程产生作用，CSL依赖的信号途径（经典途径）和CSL非依赖的途径（非经典途径）。

3.1.1经典途径

未活化的Notch受体被高尔基体中成对碱性氨基酸蛋白酶样转化酶（Furin-like convertase）在S1位点剪切后，转运到细胞膜形成异二聚体，邻近细胞表面的Notch配体与受体胞外区结合后产生构象改变。金属蛋白酶肿瘤坏死因子α转化酶（Tumor necrosis factor alpha converting enzyme，TACE）剪切S2位点，Notch胞外区形成，但仍与胞内区保持连接。γ分泌酶剪切Notch胞外区S3位点使受体的胞内区与胞外区分离，释放活性胞内段，后者转移至细胞核，与转录调节因子RNPj 和MAML绑定，形成转录激活复合物。NICD-RBPj-MAML三重复合物诱导Notch下游靶基因表达[22]，此即经典途径。

Notch调节软骨细胞成熟、增殖、存活、分化只通过经典途径[22]。Dong等[23]的研究表明，在MPCs细胞中Notch激活，可以RBPj依赖的方式抑制所有的软骨和骨细胞的分化。在Notch激活时敲除Rbpj，可证明Notch功能获得性突变表型是Rbpj依赖型。他们还发现，敲除Prx1-Cre、RosaNotch1ICD小鼠的Rbpj，可逆转小鼠四肢软骨发育异常表型，恢复的软骨与Prx1-Cre、Rbpjflox/flox小鼠的软骨是无法区别的。这印证了在四肢软骨的分化中，Rbpj是Notch信号通路唯一的调节物[24]。Kohn等[25]敲除了Col2a1-CreERT2小鼠的Rbpj，并没有逆转对四肢软骨细胞增殖的抑制，却逆转了Notch激活导致的软骨细胞增殖和终末分化。

3.1.2非经典途径

非经典途径是软骨膜成骨和软骨激活信号重要的远程细胞非自主调节机制，可能通过调节Ihh的反应性调节软骨的分化。Shawberd等[26-27]的研究表明，CSL非依赖信号可以抑制C2C12肌原细胞系分化，表现在细胞表达截短形式的Notch胞内区，抑制CSL依赖的启动子的激活。CSL非依赖的Notch信号可能通过酪氨酸激酶（Abl）途径。突变影响Abl信号导致Notch的轻微下调可影响细胞的识别。Maillard等[28]抑制小鼠造血干细胞的经典Notch通路，发现受抑制的细胞并没有表现出缺陷。Notch受体可能有不同的方式来激活经典和非经典途径，最终导致两条通路以交互或者协同的方式相互作用，来提供必要的调节。

3.2Notch通道的抑制

Notch信号通路抑制软骨细胞的增殖，但也有研究用DAPT阻断Notch通路后会阻断细胞增殖[29]。Hilton等[20]研究发现，敲除PS1并且伴随PS2失活，导致Notch蛋白不能被酶切，从而使信号转导受到阻碍，肥厚软骨细胞发生聚集，导致严重的骨骼畸形；同时，敲除Notch1和Notch2的小鼠也表现出了同样的表型，证明了PS1和PS2失活而出现的表型也是由于Notch信号转导缺失造成的。仅敲除Notch2后也出现了与同时敲除Notch1和Notch2后一样的表型，说明Notch2蛋白在软骨内骨形成的调节中起主导作用。

3.3功能获得性与缺失性突变

为了研究间充质干细胞或软骨祖细胞Notch功能获得型突变，分别检测Prx1-Cre、RosaNotch1ICD和Col2a1-Cre、RosaNotch1ICD突变体。两种突变的小鼠具有相似的表型，如软骨形成的抑制和Sox9，Col2a1和Aggrecan（Acan）的表达抑制，表明了Notch对软骨分化产生的一种抑制效应。在Col2a1-Cre、RosaNotch1ICD小鼠中，软骨的增殖受抑制，然而间充质干细胞的增殖却在Prx1-Cre、RosaNotch1ICD小鼠中增强[25，30]。

软骨特异性Notch功能获得性突变的体内和体外模型都表现出软骨成熟的明显加速和进展，与Notch功能获得性突变小鼠的Notch信号通路在祖细胞中被激活的情况相反[23]。由于Rbpjflox/flox等位基因的敲除，RBPj依赖性Notch信号通路受损，且没有提高RBPj非依赖性Notch信号。在Rbpjflox/flox等位基因缺失时提高Notch信号，并没有加剧软骨成熟的表型，表明这个过程仅由RPBj依赖机制调控。事实上，Notch功能获得性突变对加速软骨成熟的影响，在去除Rbpjflox/flox等位基因后即消除了[20]。

Notch功能缺失性突变小鼠的研究由Hilton等完成[20]，MPC缺失上游Notch信号组分（Psen1和Psen2或Notch1和Notch2）会导致软骨细胞增殖下降和软骨成熟起始延迟。Notch功能获得性突变等位基因激活早期肢体祖细胞，导致分化和增殖细胞的维持，然而祖细胞Notch信号通路的确可以促进软骨和骨的形成。这表明RBPj依赖和非依赖性Notch信号通路在软骨的增生和分化过程中可能导致不同的结果，或是不同时间的Notch信号的抑制或激活影响软骨的发育。

4　Notch通道对软骨发育的影响

在发育早期，软骨由间充质细胞凝集而成。Notch家族在鼠和禽类间充质细胞凝聚早期表达，并在肢体发育过程中与软骨细胞的成熟有关。Crowe等[31]在鸡胚胎发育中期于假定肢体区诱导Delta 1的错误表达，阻止了前肥厚性软骨细胞分化为肥厚软骨细胞，导致软骨明显缩短，肥厚性软骨细胞最终被成骨细胞所取代形成骨骼。此外，Hayes等[16]研究表明，Notch1在鼠出生之前的关节软骨表面表达，出生后在更深的层次表达。在发育的后期和出生之后Notch受体的表达允许终末分化和软骨细胞的成熟。因此，推测Notch表现为开关效应，不是促进细胞的增殖，就是表现为终末分化，导致骨形成和出生后的骨延长。

也有报道Notch信号在发育过程中的激活是时间相关性的。Oldershaw等[32]的研究表明，在人间充质干细胞团培养中抑制Notch活化14 d的效果，与在最初的5 d阻断通路的效果相同。在人类骨髓干细胞分化为成熟软骨细胞的过程中，Notch信号转导通路对软骨的形成有抑制作用，因此Notch信号的去表达是必要的。Grogan等[33]的研究表明，Notch通路下游产物HES1/HEY1可与DNA序列中SOX9增强子识别位点相结合，抑制SOX9介导的COL2A1的转录激活，从而抑制软骨细胞特异性胶原蛋白IIα1启动子的活性。Jarriault等[34]发现，Notchl受体在最初软骨分化中短暂的表达升高，不伴有相应配体表达升高，但下游目的基因HESl表达上调。Oldershaw等[32]发现，软骨分化过程中Notchl无明显表达，说明Notch信号可能参与了软骨分化的早期激活。Noteh2受体表达水平大幅下降，但Notch3下降较缓慢而持久，从而Notch3成为高表达受体，这可能与Notch3在抑制骨髓充质干细胞的增殖和其向软骨方向分化有关。JAGl基因介导的Notch信号抑制Mscs向软骨细胞分化，从而保持未分化状态，进一步证明Notch通路的激活是启动软骨细胞分化的关键。短暂的Notch信号被启动，出现向软骨细胞分化的触发信号，从而出现类似瀑布效应，激活下游的信号并上调关键基因，但在分化过程中该通道必须关闭，以保证分化的正常进行。因MSCs的多潜能分化特性，可能还存在未被探究的更加精确的诱导和调控软骨发育分化的机制。

Notch家族成员可在出生后的关节软骨亚种中表达，关节软骨的持续发育及软骨祖细胞亚单位的命运都可能被Notch信号通路调节。Dowthwaite等[35]的研究表明，7日龄小牛中，Notch信号受体在关节软骨的表面表达，这与之前发育中小鼠的关节软骨表现相符合。这些细胞与不表达Notch受体的软骨相比，表现为克隆效率的增加。这表明Notch受体最初的作用是调控软骨克隆性。成人关节软骨表面区域超过70%的软骨细胞表达Notch1受体[36]。Karlsson等[14]培养人关节软骨细胞，证明阻断Notch信号通路激活可降低软骨细胞的增殖。虽然以上结果支持Notch信号主要维持克隆性而不是分化，但也不排除可促进软骨细胞的终末分化。因此，Notch在出生后促进增殖或者分化方面的确切作用仍不清楚。

5　小结

在软骨发育初期，Notch信号转导通路的调节作用已有表现，在随后的发育分化全过程中，通过经典途径和非经典途径的协调作用，不同的受体、配体的差异表达，从而影响软骨的分化发育和增殖成熟，维持体内软骨和骨的平衡状态，且这种调节表现为时间和空间的相关性。考虑到受体、配体之间的相互影响，Notch通道受配体共表达可能是另一种Notch信号转导通路对软骨分化发育的调节机制。此外，Notch信号转导通路与其他信号途径及细胞因子的相互影响仍需进一步研究。深入探究调控Notch信号转导通路的有效方式，通过Notch通道的调控来精确控制和预测软骨细胞的增殖、发育与定向分化，对临床和相关研究都具有重要意义。

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收稿日期：（2015年9月25日；修回日期：2015年11月30日）

通讯作者：范飞（E-mail：fanfei1962@gmail.com）。

基金项目：中国医学科学院整形外科医院院所基金重大项目。

doi:10.3969/j.issn.1673-0364.2016.01.012

【中图分类号】R318.1

【文献标识码】B

【文章编号】1673－0364（2016）01－0044－04