白芨种子无菌萌发研究

马丹,杨柏云

(南昌大学 生命科学学院,江西 南昌 330031)

白芨种子无菌萌发研究

马丹,杨柏云

(南昌大学 生命科学学院,江西 南昌 330031)

摘要：为探讨白芨(Bletilla striata (Thunb.) Teichb.f.)种子无菌萌发适宜条件,采用TTC法染色测定了种子活力,MS培养基添加不同生长剂以及蜗牛酶处理进行了白芨种子萌发实验。结果表明:4 ℃低温保存白芨种子可使其在较长时间种子活力在93.0%以上;在培养温度为(25±2) ℃,光照强度1 000 lx,光照时间12 h/d,以MS+0.03 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+0.5%活性炭为生长调节剂萌发培养基最为适宜,种子萌发率可达91.6%;采用水浴25 ℃ 处理40 min,酶浓度为3% 蜗牛酶处理后种子萌发率最高,萌发率为93.4%。

关键词：白芨;无菌萌发;种子活力;生长调节剂;蜗牛酶

收稿日期：2015-07-06

作者简介：马丹(1990—)，女，江西南昌人,南昌大学生命科学学院硕士研究生。

通讯作者：杨柏云(1963—),男,江西南昌人,硕士生导师,教授,主要从事园林植物生物技术的研究工作。

中图分类号：S567.2

文献标识码：B

文章编号：编号：1674-9944(2015)09-0078-04

1引言

白芨(Bletillastriata(Thunb.) Teichb.f.)为兰科(Orchidaceae)白芨属(Bletilla)多年生草本植物[1],其块茎为我国传统中药,具有收敛止血、消肿生肌等功效,常用于治疗咳血吐血、疮疡肿毒等疾病[2]。白芨种子细小、种皮为单层细胞组成,胚不分化,无胚乳,在野生条件下很难萌发[3]。目前由于人工无节制采挖导致白芨野生资源紧缺,已被国家列为珍稀濒危植物。白芨蒴果包含上万粒种子,利用组织培养技术对白芨进行无菌萌发,可以提高其萌发率,得到大量组培苗,是解决传统分株繁殖效率低的重要手段。为进一步优化白芨种子萌发,本研究探讨不同培养条件对白芨种子萌发的影响,为其组织培养快速繁殖提供理论依据。

2材料与方法

2.1　材料

实验所用的白芨蒴果,由江西省植物资源重点实验室提供。种龄约150 d,果实饱满,无开裂,实验材料带回实验室后存置于4 ℃的冰箱中储藏,备用。

2.2　方法

2.2.1白芨蒴果消毒

将成熟的白芨蒴果刷洗干净,自来水冲洗10 min~15 min后,用75%的乙醇浸泡7~8 min,再用0.1%的HgCl2浸泡灭菌8 min,在超净工作台上用无菌水反复冲洗干净后,用无菌滤纸吸干水分,待用。

2.2.2不同贮藏时间对种子活力的影响

对刚采集的种子和4 ℃冰箱里保存有7 d、30 d、60 d的白芨蒴果经过消毒后,将白芨种子分别等量均匀的播撒在不同的培养皿内,编号A、B、C、D。加入适量的0.5% TTC溶液,以覆盖种子为度,25 ℃黑暗条件下染色24 h,实验重复3次。染色完成后,再用蒸馏水将种子冲洗3~5次,显微镜下观察种子的染色情况。

2.2.3生长调节剂对白芨种子无菌萌发影响

以TDZ、NAA、6-BA为因素,将白芨种子均匀抖落散布培养基上(表1),随即封口,做好标记。每瓶播种等量的种子,每组接种30瓶。基本培养基选用MS培养基+35 g/L蔗糖,固体培养基添加7 g/L琼脂粉和0.5 g/L 活性炭,pH为5.6~5.8。同时,不添加NAA、6-BA和TDZ为对照组。先将培养基置于暗条件下培养,种子萌发后再移至光照条件下,培养温度为(25±2) ℃,光照强度1 000 lx,光照时间12 h/d。每隔7d观察各组染菌情况,记录各种处理的萌发及生长情况(表1)。

表1　无菌萌发播种培养基

2.2.4蜗牛酶对白芨种子无菌萌发的影响

将蜗牛酶配成质量浓度1%、3%、6%的溶液,于0.45μm的微孔有机薄膜过滤除菌,以蜗牛酶浓度、水浴时间、水浴温度设为3个因素,在3水平下进行正交实验,每组播种30瓶,培养基为MS培养基+35 g/L蔗糖,培养条件同1.2.3,每隔7 d检查其污染情况,剔除染菌的培养瓶,记录各种处理的萌发及生长情况。每隔10 d在超净操作台上随机选取10瓶,计录种子萌发率(表2)。

2.3　数据分析

用SPSS统计分析软件对实验数据进行分析。

表2　蜗牛酶对无菌种子萌发的影响

3结果与分析

3.1　不同贮藏时间对种子活力的影响

种子生活力是指种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力。白芨种子活力与被染的颜色的深度成正比。由图1可知,7 d时白芨种子的胚染色呈深红色,有强的活力;30 d时白芨种子的胚染色呈鲜红色,有较强的活力;60 d时白芨种子的胚染色呈粉红色,有活力。对种子活力图极性颜色对比分析,种子活力随着储存天数的增加,种子活力在不断降低,但白芨种子活力均在93.0%以上。7 d、30 d、60 d种子活力分别是是95.2%、94.3%、93.5%。由此可知,在本研究中,贮藏在4 ℃的冰箱里使用的白芨种子均有较强的活性。

图1　白芨种子TTC染色图

3.2　生长调节剂对白芨种子无菌萌发的影响

由表3可知,白芨种子培养50 d后,TDZ、NAA和6-BA三种生长调节剂均明显地提高了白芨种子的萌发率。不同浓度激素处理的白芨种子萌发启动快慢影响不大,相差最多10 d。NAA、TDZ和6-BA三种生长调节剂对白芨的萌发具有促进的作用5、6、8、3号培养基萌发率提高了69.3%、57%、49.9%、47.3%,促进效果最佳的是MS+0.03 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA。

表3　生长调节剂对白芨种子无菌萌发的影响

2.3　蜗牛酶对白芨种子无菌萌发的影响

种子初始萌发时间是反应种子萌发快慢的指标。由表4和5可知:相同培养条件下,蜗牛酶对白芨种子萌发影响有显著差异。蜗牛酶在上述处理条件下均可提高白芨种子萌发率,而且能促进种子萌发时间缩短,生长整齐,为白芨组织快速繁殖提供原球茎,最适处理方法为:25 ℃,40 min,酶浓度3%。

表4　蜗牛酶对白芨无菌种子萌发的影响

表5　蜗牛酶处理及对照组下正交实验观察结果

4结语

种子活力是进行种子萌发试验能否进行成功的关键因素。白芨自从采集后随着贮藏时间延长,白芨种子的活力指数的线条呈逐渐下降的走势,种子活力随着贮藏时间的延长而缓慢降低。短时间内低温保存均可使白芨种子保持较高活性,适宜播种。

生长调节剂促进兰科种子萌发的研究早有研究也已被证明,生长调节剂对白芨种子萌发的影响的研究也有差别,这是由于使用外源植物激素可以打破种子休眠,在一定的激素浓度下可促进白芨种子的萌发率。而基本培养基中的活性炭的加入,主要起到吸附释放出来的有害物质和净化白芨生长微环境的作用,并且碳粉可以抑制萌发过程的褐化,可提高种子萌发率,降低污染率。

白芨种子的胚,贮藏营养物质很少,胚乳极度缺乏大量的碳水化合物、蛋白质和脂肪等营养物质。加之,

兰科植物种子普遍存在种皮厚密、透性差或种皮存在抑制物等有关[4]。本试验选择蜗牛酶的原因是蜗牛酶通过酶解白芨种子的细胞壁,提高白芨种子萌发率。

采用4 ℃低温保存白芨种子可使其在较长时间种子活力在93.0%以上;在培养温度为(25±2) ℃,光照强度1 000 lx,光照时间12 h/d下,考虑以MS+0.03 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+0.5%活性炭为生长调节剂萌发培养基最为适宜,种子萌发率可达91.6%,或采用水浴25 ℃,水浴时间为40 min,浓度为3% 蜗牛酶处理后种子萌发率最高,萌发率为93.4%。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社,2009.

[2] 张燕,黎斌,李思锋.不同培养基上白芨的种子萌发与幼苗形态发生[J].西北植物学报,2009(8):1584~1589.

[3] 叶静,郑晓君,管常东,等.白芨的无菌萌发与组织培养[J].云南大学学报:自然科学版,2010,32(1):422~425.

[4] 张建霞,付志惠,李洪林,等.白芨胚发育与种子萌发的关系[J].亚热带植物科学,2006,34(4):32~35.